王洋，王競?cè)?，羅云龍，白東清，季延濱，余政豪，淡清華，于波

(天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

水產(chǎn)動物免疫水平低，易患細菌性疾病，從而導致嚴重的生產(chǎn)損失。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中為提高水產(chǎn)動物抗病力、降低死亡率最常采取的有效方式之一就是施用抗生素或一些化學合成藥物。然而，化學藥物安全性低，易產(chǎn)生藥物殘留，殺菌效果不理想，而抗生素的濫用又會造成細菌耐藥性產(chǎn)生，故這些抗生素或化學藥物現(xiàn)已被逐漸淘汰和限制使用，因此，尋求良好的抗生素替代品是水產(chǎn)養(yǎng)殖界最為關(guān)心的課題之一[1]。目前，抗菌肽作為新型抑菌物質(zhì)，其功能、性質(zhì)，及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用前景均引起了人們的關(guān)注[2]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)廣泛分布于人、畜、禽、水產(chǎn)等動物體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)，部分菌株可以作為水產(chǎn)益生菌，提高水產(chǎn)動物的抗病性能[3-4]。其作用機理包括：直接分泌抗菌物質(zhì)、拮抗病原菌[5]；刺激宿主免疫，增強宿主免疫相關(guān)酶和抗氧化酶活性，提高機體免疫水平[6-7]等。乳酸菌的抗菌代謝產(chǎn)物主要包括有機酸[8]、細菌素[9]和過氧化氫[10]等。L(+)-乳酸是一種乳酸菌利用糖類所產(chǎn)生的基本代謝產(chǎn)物，具有良好抑菌殺菌作用[11]，易被人體代謝[12]，美國食品藥品管理局認定其為一般公認的安全食品添加劑(GRAS)。乳酸菌細菌素是部分乳酸菌產(chǎn)生的一類對革蘭氏陽性菌具有顯著抑殺作用的肽類(少數(shù)乳酸菌細菌素可抑制革蘭氏陰性菌)[13]。Verschuere等[14]指出，細菌素有望成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的替代品。

水產(chǎn)動物的致病微生物多為革蘭氏陰性菌，如嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、維氏氣單胞菌Aeromonasveronii、愛德華氏菌Edwardsiellatarda、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus、鰻魚弧菌Vibrioanguillarm、溫和氣單胞菌Aeromonassobria、殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida、熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens、水型點狀假單胞菌Pseudomonaspunctata和腸型點狀氣單胞菌Aeromonaspunctata等。革蘭氏陰性病原菌通常對有機酸敏感，但對低濃度酸具有一定耐受性[15]。由于水產(chǎn)動物腸道較短，且微生物數(shù)量較少，因此，益生乳酸菌在水產(chǎn)動物腸道內(nèi)產(chǎn)生的乳酸濃度未必足以殺死全部致病菌。因此，產(chǎn)酸特征不足以保證乳酸菌提高宿主抗細菌病的能力。實際應用研究發(fā)現(xiàn)，各類乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用效果具有明顯的菌株特異性[16]。本團隊前期研究證明，在產(chǎn)酸能力相當時，產(chǎn)細菌素的乳酸菌對革蘭氏陰性菌具有更強的控制力[17]。Nyk?nen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵物與乳酸對魚源熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens及銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa有協(xié)同抑制。因此，本研究中提出假設(shè)：乳酸菌的兩類抑菌產(chǎn)物，細菌素與乳酸具有協(xié)同抑制革蘭氏陰性菌的作用。為證明這一假設(shè)，本研究中選用目前商業(yè)化的乳酸鏈球菌素(nisin)，研究其與低濃度乳酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要危害菌——維氏氣單胞菌的抑殺作用與機理，并提出了乳酸菌提高水產(chǎn)動物抗病性的一種新機理，旨在為篩選產(chǎn)細菌素乳酸菌作為水產(chǎn)益生菌提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

維氏氣單胞菌分離自患腸炎病的錦鯉Cyprinuscarpio。

試劑：L-乳酸(以下簡稱乳酸，記為la)，純度>90%(西隴化工股份有限公司)；食品級nisin(天津艾瑪斯特生物科技有限公司)，推薦使用量為0.03～0.20 g/kg；LB培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)。

儀器：全波長掃描式多功能讀數(shù)儀Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific，美國)；全自動生長曲線分析儀Bioscreen C(Bioscreen Company，芬蘭)；環(huán)境掃描電子顯微鏡Quanta 200FEG(FEI Company，荷蘭)。

1.2 方法

1.2.1 nisin與乳酸對指示菌的生長抑制

1)比濁法測定生長抑制效果。將活化好的維氏氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基，配制成活菌數(shù)為1×107CFU/mL。在菌液中分別加入蒸餾水、乳酸或nisin溶液，試驗設(shè)置對照組、4 mmol/L 乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L 乳酸+nisin(0.01、0.05 g/L)處理組。每組樣品取100 μL，加入96孔板中，于30 ℃下培養(yǎng)12 h，以酶標儀測定OD600 nm值。

2)生長曲線及生長參數(shù)。將活化好的維氏氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基，配制成活菌數(shù)為1×107CFU/mL。在菌液中分別加入蒸餾水、乳酸或nisin溶液，分別制成對照組、4 mmol/L乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L乳酸+nisin(0.01、0.05 g/L)處理組。每組樣品取200 μL，加入生長曲線儀專用培養(yǎng)板中，采用全自動生長曲線分析儀，于30 ℃下連續(xù)培養(yǎng)至48 h，期間每間隔30 min測定一次OD600 nm值，繪制生長曲線，以修正的Gomptz模型擬合[19]，計算生長延滯期(lag time)、比生長速率(μmax)、平臺期最大活菌數(shù)(OD600 nm max)等生長參數(shù)。

1.2.2 nisin與乳酸對指示菌的致死作用 將活化好的維氏氣單胞菌重懸于生理鹽水溶液中，配制成活菌數(shù)為1×105CFU/mL，在菌液中分別加入蒸餾水、乳酸或nisin溶液，制成對照組、4 mmol/L乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L 乳酸+0.05 g/L nisin處理組。定時取樣以平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.2.3 菌株運動能力測定 運動性檢測培養(yǎng)基為0.5% NaCl、1%胰蛋白胨、0.25%瓊脂，于121 ℃下滅菌15 min后制備平板。平板上分別加入 1 μL 經(jīng)未處理、 4 mmol/L 乳酸處理、0.05 g/L nisin處理、4 mmol/L乳酸+0.05 g/L nisin處理8 h的維氏氣單胞菌，30 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落直徑[20]。

1.2.4 生物被膜檢測 用無菌生理鹽水洗滌對數(shù)末期的維氏氣單胞菌3次,用LB 重懸至 1×108CFU/mL。試驗設(shè)置4組，分別為對照組(蒸餾水)、 4 mmol/L乳酸處理組、0.05 g/L nisin處理組、4 mmol/L乳酸+ nisin (0.005 g/L、0.01 g/L、0.05 g/L )處理組。于 30 ℃下培養(yǎng)36 h 后，孔內(nèi)加滿結(jié)晶紫試劑[21]染色30 min后，結(jié)晶紫附著于生物被膜，棄去多余的結(jié)晶紫后，用等體積無水乙醇將附著于生物被膜的結(jié)晶紫洗脫，測定OD595 nm值(結(jié)晶紫的吸光值，吸光值大小反映體系中結(jié)晶紫的濃度高低，結(jié)晶紫濃度的高低反映生物被膜量的多寡)。

在加入爬片的24孔聚苯乙烯孔板中，分別設(shè)置對照組(400 μL菌液+100 μL生理鹽水)、 400 μL菌液+50 μL 4 mmol/L乳酸+50 μL 生理鹽水、400 μL菌液+50 μL 0.05 g/L nisin+50 μL 生理鹽水、400 μL菌液+50 μL 0.05 g/L nisin+50 μL 4 mmol/L乳酸共4組，于30 ℃下培養(yǎng)72 h后，以無菌HEPES緩沖液清洗去除懸浮菌體。結(jié)晶紫染色1.0～1.5 min后，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 質(zhì)子動勢和膜電動勢 維氏氣單胞菌(106～107CFU/mL)懸于HEPES緩沖液，以葡萄糖能量化[22]。

1)nisin對膜電動勢(ΔΨ)消散作用的測定。加入1 μmol/L尼日利亞菌素來處理菌體以消除跨膜pH梯度差(ΔpH)，之后加入電動勢熒光探針DisC3(5)孵育，分別設(shè)置空白對照組(蒸餾水)、4 mmol/L乳酸處理組、 0.05 g/L nisin處理組、 4 mmol/L乳酸+ 0.05 g/L nisin處理組，并以多功能酶標儀連續(xù)測定熒光強度的變化[23]。

2) nisin對ΔpH影響的測定。向能量化菌懸液中加入1 μmol/L纈氨霉素以徹底消除ΔΨ，并加入熒光染料BCECF-AM(終濃度為3 μmol/L)孵育。4個組別設(shè)置同上，使用多功能酶標儀連續(xù)記錄熒光強度[24]。

1.2.6 掃描電鏡 收集對數(shù)末期維氏氣單胞菌，以生理鹽水溶液重懸，4個組別設(shè)置同“1.2.5節(jié)”，處理12 h后取樣，固定處理樣品[25]，利用環(huán)境掃描電子顯微鏡來采集細胞表面結(jié)構(gòu)的圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行方差分析，用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。利用Excel軟件計算各組數(shù)據(jù)的標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 nisin和乳酸對維氏氣單胞菌生長的協(xié)同抑制作用

從圖1A可見：對照組維氏氣單胞菌的OD600 nm值為1.37，nisin單獨處理組為1.31，與對照組相比，單獨添加nisin未影響OD600 nm值(P>0.05);乳酸處理組OD600 nm(0.90)顯著降低(P<0.05)；在加入乳酸的基礎(chǔ)上添加 0.01 g/L nisin，維氏氣單胞菌的OD600 nm值顯著下降至0.38，且隨著nisin質(zhì)量濃度的升高，下降幅度更大，當nisin質(zhì)量濃度達到0.05 g/L 時，OD600 nm顯著低于所有處理組(P<0.05)。

從圖1B可見：在培養(yǎng)的48 h內(nèi)，對照組菌體快速增長，OD600 nm值迅速升高，很快進入對數(shù)期和平臺期，nisin單獨處理組的生長趨勢與對照組類似；乳酸的存在明顯干擾了菌體的生長，且在乳酸基礎(chǔ)上進一步添加nisin對維氏氣單胞菌的生長均表現(xiàn)出顯著地抑制，并且抑制程度隨著細菌素nisin質(zhì)量濃度的增加而提高。

從表1可見：在乳酸和細菌素協(xié)同處理下，維氏氣單胞菌的延滯期延長，μmax值和OD600 nm max值有所下降，且隨著細菌素質(zhì)量濃度升高，各參數(shù)也顯著變化(P<0.05)，證明nisin和乳酸對革蘭氏陰性病原菌有聯(lián)用抑制效果；在4 mmol/L乳酸處理下，0.05 g/L nisin的添加可將菌株延滯期從5.12 h延長至23.51 h，OD600 nm max值由1.39降低至1.20，μmax值從對照的0.36降低至0.11。

表1 nisin及乳酸協(xié)同對維氏氣單胞菌生長主要參數(shù)的影響(乳酸濃度4 mmol/L)

2.2 nisin和乳酸對維氏氣單胞菌的協(xié)同致死作用

從圖2可見：與對照組相比，在處理的36 h內(nèi)，nisin單獨處理組對維氏氣單胞菌并無致死作用，4 mmol/L乳酸處理組可造成菌體死亡；4 mmol/L乳酸和0.05 g/L nisin協(xié)同處理組，與同濃度乳酸或nisin單獨處理組相比，活菌數(shù)量大大降低，致死效果最為明顯，菌體在36 h 后已被全部殺死，表明二者協(xié)同作用發(fā)揮的抑菌效果比單獨作用更顯著。

2.3 nisin與乳酸協(xié)同對維氏氣單胞菌運動性影響

從圖3可見：僅nisin組菌落擴散直徑與對照組相比，無顯著性差異(分別為18.24、17.63 mmol/L)(P>0.05)；加入4 mmol/L 乳酸后的維氏氣單胞菌的擴散直徑顯著減小至14.49 mmol/L(P<0.05)，為對照組的79.44%，而nisin+乳酸處理組菌落的擴散直徑為對照組的61.79%，這表明乳酸與nisin協(xié)同處理能夠顯著減弱維氏氣單胞菌的運動性，其中，病原微生物擴散的直徑大，表現(xiàn)了菌體的運動性強，反之即運動性弱。

2.4 nisin與乳酸協(xié)同對維氏氣單胞菌生物被膜形成能力的影響

不同濃度nisin和乳酸協(xié)同處理108CFU/mL的維氏氣單胞菌，在培養(yǎng)第36 h時取樣測定，其結(jié)果如圖4所示。從圖4A可見：nisin處理組和乳酸單獨處理組的OD595 nm值與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，這表明單獨的nisin 或者乳酸處理無法減少維氏氣單胞菌生物被膜的生成；而乳酸+nisin的聯(lián)用處理組與對照組相比，其生物被膜的生成量明顯降低，且降低幅度隨nisin含量的增加而提高，其中,4 mmol/L乳酸+0.05 g/L nisin處理組被膜生成量僅為對照組的27.43%。圖4B直接顯示了乳酸和nisin對維氏氣單胞菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響，乳酸和nisin協(xié)同處理顯著降低了爬片上維氏氣單胞菌的數(shù)量，說明協(xié)同處理抑制了菌體黏附。

2.5 nisin 與乳酸對維氏氣單胞菌膜電動勢的影響

膜電動勢的大小由熒光探針DiSC3(5)的熒光強度反映。DiSC3(5)能夠聚集在超極化的細胞膜表面，而進入胞內(nèi)后熒光消失。熒光值減小即細胞膜ΔΨ上升，反之則消散。從圖5A可見,乳酸處理組菌體反映ΔΨ的初始熒光值(4 h內(nèi))較對照組高，這一現(xiàn)象表明，經(jīng)乳酸處理后的病原體細胞膜電動勢降低，而且革蘭氏陰性菌的熒光值此后持續(xù)降低也證明了病原微生物在反應過程中ΔΨ不斷升高。與對照組及乳酸處理組相比，乳酸+0.05 g/L nisin處理時，維氏氣單胞菌的最初熒光值較高，證明細胞膜在一剎那產(chǎn)生極化，熒光值此后持續(xù)增加，這表明細胞膜電動勢在不斷消散。由此推測，細菌素能夠?qū)?jīng)過乳酸處理的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抑制作用，nisin會導致菌體ΔΨ消散；而nisin質(zhì)量濃度越高，形成的孔洞也越多，其離子泄漏速率也越快，即膜電動勢的消散速度越快。

從圖5B可見：未經(jīng)乳酸處理的維氏氣單胞菌反映ΔpH的熒光值不斷增加，說明菌體的膜質(zhì)子動勢在這一過程中不斷上升；而經(jīng)單獨乳酸處理及在乳酸基礎(chǔ)上加入 0.05 g/L nisin 后，菌體的初始熒光值均與對照組較低，這一現(xiàn)象表明細胞膜在一瞬間產(chǎn)生了極化。此后，不斷降低的熒光值表明膜ΔpH持續(xù)消散，這一現(xiàn)象證明細菌素能夠損傷經(jīng)乳酸處理的維氏氣單胞菌，并使膜質(zhì)子動勢消散；且la+nisin處理組熒光值下降幅度明顯，這表明nisin 對維氏氣單胞菌的抑制可能與其對敏感革蘭氏陽性菌的抑制機理類似，在有乳酸的情況下，細菌素能夠侵入細胞膜，進而導致離子泄漏，造成質(zhì)子動勢消散。

2.6 nisin與乳酸對維氏氣單胞菌膜菌體結(jié)構(gòu)影響

圖6為環(huán)境掃描電子顯微鏡拍攝的維氏氣單胞菌表面形態(tài)特征，維氏氣單胞菌在LB 培養(yǎng)基中呈現(xiàn)兩端鈍圓的桿狀，菌體表面光滑飽滿。乳酸處理組和協(xié)同處理組的菌體表面有明顯缺失。其中，4 mmol/L乳酸環(huán)境培養(yǎng)的維氏氣單胞菌表面破損，發(fā)生嚴重形變，菌體的大小不均一(白色實線箭頭)，這一現(xiàn)象驗證了乳酸通過破壞細胞壁，增進細菌素效力的假設(shè)；乳酸與nisin 協(xié)同處理的維氏氣單胞菌與對照組相比發(fā)生明顯改變，菌體出現(xiàn)嚴重變形(黑色虛線箭頭)，菌體表面可見較多孔洞(黑色實線箭頭)和裂解菌體碎片(白色虛線箭頭)。試驗結(jié)果表明，乳酸與nisin可以改變維氏氣單胞菌的菌體形態(tài)。

3 討論

3.1 nisin與乳酸對維氏氣單胞菌有協(xié)同抑殺作用

本研究中通過生長抑制和致死試驗證明，乳酸鏈球菌素nisin和乳酸對維氏氣單胞菌有協(xié)同抑制和致死作用，且抑制效果隨著nisin質(zhì)量濃度的增加而提高。乳酸是乳酸菌中一類重要抗菌代謝產(chǎn)物，對大部分微生物具有良好的控制效果。nisin是I類乳酸菌細菌素的重要代表，對革蘭氏陽性病原微生物如李斯特菌屬Listeria、芽孢桿菌屬Bacillus和葡萄球菌屬Staphylococcus等病原菌具有良好的抑殺效果，但對革蘭氏陰性菌無效[26]。Roth等[27]曾報道過低濃度乳酸可造成革蘭氏陰性菌非致死性損傷，并提高其對細菌素的敏感性。應用研究也發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)細菌素的乳酸菌在水產(chǎn)動物體內(nèi)對革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌如嗜水氣單胞菌具有良好的控制效果[28]。產(chǎn)細菌素的乳酸菌在食品體系中與同等產(chǎn)酸菌株相比對革蘭氏陰性菌有更強的抑制能力[17]。本研究中證明，4 mmol/L乳酸和0.05 g/L的nisin協(xié)同可顯著抑制維氏氣單胞菌的生長，延長延滯期，降低最大比生長速率，這將有利于生產(chǎn)中控制或推遲病原菌的增殖，降低水產(chǎn)動物的患病風險。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，nisin和乳酸可以協(xié)同降低維氏氣單胞菌的運動性和生物被膜的形成。維氏氣單胞菌普遍具有運動性[29]，更有利于其生存、擴散及造成感染[30]，因而抑制運動性能夠有效控制維氏氣單胞菌的擴散及毒力。生物被膜是維氏氣單胞菌易造成持續(xù)感染的另一重要原因，被膜態(tài)對菌體有一定的保護作用，并有利于群體信息交流及產(chǎn)生毒力[31-32]。本研究中，在nisin與乳酸共同存在的條件下，維氏氣單胞菌形成被膜的能力受到抑制，被膜結(jié)構(gòu)變得松散。這不僅控制了群體的增殖，也能提高菌群對其他抑菌作用的敏感性[33]。nisin與乳酸協(xié)同抑菌效應的存在有利于提高乳酸菌在環(huán)境中對病原微生物的抗性。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用產(chǎn)細菌素乳酸菌，可能成為無抗養(yǎng)殖大環(huán)境下提高水產(chǎn)動物抗細菌性疾病的重要方式之一[34-37]。

3.2 nisin與乳酸協(xié)同損傷維氏氣單胞菌作用機制

nisin與乳酸對維氏氣單胞菌的協(xié)同損傷作用，可能來源于二者對細胞結(jié)構(gòu)的分別損傷及相互促進作用。革蘭氏陰性菌對細菌素的抗性可能主要來源于細胞壁 (外膜) 保護[38]。去除細胞壁后抗性革蘭氏陰性菌就會對細菌素敏感[39]。Alakomi等[40]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸可以增加革蘭氏陰性菌外膜(細胞壁)的通透性。本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳酸處理后，nisin可以使維氏氣單胞菌的膜電動勢 (ΔΨ) 及pH梯度 (ΔpH) 消散，說明乳酸與nisin同時存在會對嗜水氣單胞菌內(nèi)膜完整性造成一定程度的影響，膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到干擾，進一步降低膜內(nèi)pH，影響膜內(nèi)物質(zhì)合成和分解代謝，這與nisin對敏感陽性菌的作用機制相似[41-42]。另一方面，掃描電鏡觀察到乳酸處理后，菌體表面有明顯的損傷，nisin和乳酸共同處理后，菌體表面出現(xiàn)更嚴重的破損和孔洞，菌體周圍也出現(xiàn)與nisin作用于革蘭氏陽性菌類似的外膜小泡[43]。此外，nisin對內(nèi)膜的損傷作用可能進一步促進乳酸進入細胞， 造成較同等濃度下乳酸單獨存在時更為嚴重的損傷。后期深入解析nisin和乳酸對細胞內(nèi)外膜的損傷過程及機理將有助于更好地理解二者協(xié)同抑菌的機制。

4 結(jié)論

1)本研究中證明了乳酸和細菌素nisin對革蘭氏陰性病原菌有協(xié)同抑制和致死作用。

2)nisin和乳酸聯(lián)用能夠有效限制維氏氣單胞菌的運動性，抑制其生物被膜產(chǎn)生。

3)對于被乳酸破壞外膜的維氏氣單胞菌，nisin能夠顯著增加其膜通透性，并降低其膜電動勢和pH梯度差，這與nisin作用于敏感革蘭氏陽性菌的機制類似。