張 蕾，章敬旗，章瑋月，糜 娟，何文杰，王 健

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

0 引言

【研究意義】家禽的繁殖過程受到下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，該軸可分泌一系列激素從而影響家禽產(chǎn)蛋和繁殖周期[1?2]。正常情況下，家禽的性成熟開始于下丘腦分泌的GnRH（Gonadotropin-releasing hormone，性腺激素釋放激素），從而刺激垂體分泌促LH（Luteinizing hormone，黃體生成素）和FSH（Follicle-stimulating hormone，促卵泡激素），這些相互關(guān)聯(lián)的激素將觸發(fā)鞘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞合成性腺類固醇（雌二醇、睪酮、黃體酮），從而促進(jìn)卵巢中卵泡的生長，也包括排卵前卵泡的發(fā)育和排卵[3?5]。家禽這種控制卵子形成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)不僅僅使輸卵管和卵巢發(fā)生相應(yīng)生理變化，也刺激肝臟中相關(guān)激素依賴基因的表達(dá)[6?8]。肝臟中這些激素依賴基因的表達(dá)同時也支持著與生殖器官發(fā)育相關(guān)的脂質(zhì)變化，包括蛋黃以及支持組織的形成等過程[9?10]。由此可見，肝臟在家禽產(chǎn)蛋過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明，開產(chǎn)后蛋雞的肝臟活動發(fā)生變化，開始合成大量的脂蛋白[11?12]。Li 等[13]首次對蛋雞不同產(chǎn)蛋時期的肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了對比分析，構(gòu)建了蛋雞肝臟中的脂肪代謝模式；張臻等[14]應(yīng)用RNA-seq 技術(shù)對首次產(chǎn)蛋前后的雞肝臟組織進(jìn)行對比分析，獲得了222 個差異基因，這些基因影響了肝臟中物質(zhì)代謝途徑的變化。我國養(yǎng)鵝歷史悠久，是全球鵝品種資源遺傳多樣性最豐富的國家，現(xiàn)已知經(jīng)國家或地方鑒定的大中小型地方鵝品種或者培育品種有40 多個[15]。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，“安全、營養(yǎng)、健康、綠色”的食品需求日益遞增，鵝蛋、鵝肉等產(chǎn)品已經(jīng)逐漸開始成為大眾的消費熱潮[16]。在養(yǎng)鵝生產(chǎn)蓬勃發(fā)展的推動下，對鵝優(yōu)良品種的選育提出了更高的需求，推動了鵝遺傳繁育研究工作的進(jìn)展。泰州鵝是泰州市肉蛋兼用型地方優(yōu)良畜禽資源，10 周齡體重可達(dá)4.0 kg，肉質(zhì)優(yōu)良；母鵝初產(chǎn)年產(chǎn)蛋量可達(dá)60～65 枚，高于大多數(shù)國內(nèi)外其他大中型鵝種?！颈狙芯壳腥朦c】但是由于受到季節(jié)性繁殖的限制和其他商品鵝配套系的沖擊，泰州鵝種質(zhì)資源一直未能很好地開發(fā)與利用。目前有關(guān)鵝產(chǎn)蛋過程中肝臟分子調(diào)控機(jī)制的研究甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過RNA-Seq 技術(shù)，對首次開產(chǎn)前后泰州鵝的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了對比分析。通過挖掘篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行GO分析和KEGG 生物信息學(xué)分析，以獲得參與泰州鵝肝臟中與其開產(chǎn)相關(guān)的候選關(guān)鍵基因和信號通路，為加速泰州鵝地方種群的進(jìn)一步選育以及特色配套系的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所用的泰州鵝為江蘇省泰州市豐達(dá)水禽育種提供，選擇同一來源（同批孵化、同批出雛、同一環(huán)境下予以全價日糧自由采食）的健康鵝群。隨機(jī)抽樣選取開產(chǎn)前10 周齡泰州鵝個體3 只（樣品編號1、2、3）以及開產(chǎn)后40 周齡泰州鵝個體3 只（樣品編號4、5、6）。按照國家實驗動物處理行為準(zhǔn)則進(jìn)行屠宰，并立即采取肝臟組織放入無酶凍存管，保存于液氮中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測序 通過Trizol 法進(jìn)行泰州鵝肝臟組織總RNA 提取，Nanodrop 檢測提取的RNA 純度，Qubit 2.0 檢測提取的RNA 濃度，Aglient 2100 檢測RNA 的完整性。所有樣品RNA 提取并檢測合格后，用干冰保存并送至上海歐易生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用Illumina HiSeq2500 高通量測序平臺進(jìn)行測序分析[17]。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)分析 對測序濾得的clean data，通過TopHat2 軟件進(jìn)行序列比對，獲得泰州鵝肝臟樣本特異序列信息，并進(jìn)行基因組定位分析。以|log2Fold change|≥1（P＜0.05）為閾值進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，結(jié)合GO（Gene Ontology，基因本體）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫對篩選獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋及通路富集分析[18]。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 隨機(jī)選取1.2.2 中獲得的5 個差異表達(dá)基因，采用Oligo 7.5 軟件設(shè)計qRT-PCR 引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄得到的開產(chǎn)前后泰州鵝肝臟樣本（樣本號1～6）的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，驗證上述基因的表達(dá)規(guī)律。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SEM）表示，應(yīng)用SPASS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用兩樣本均數(shù)間t檢驗的方法，以P＜0.05 視為差異顯著（“*”表示）；P＜0.01 視為差異極顯著（“**”表示）。目的基因表達(dá)量qRT-PCR 結(jié)果分析采用 2?△△Ct方法。

表 1 qRT-PCR 引物序列、退火溫度以及目的片段大小Table 1 Primer sequences, annealing temperature, andpredicted length for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 開產(chǎn)前后泰州鵝肝臟組織轉(zhuǎn)錄組測序

本試驗共構(gòu)建開產(chǎn)前后泰州鵝6 個肝臟組織轉(zhuǎn)錄組文庫，從表2 中可以看出，本試驗6 個樣品獲得75 754 528～81 525 658 條reads，測序數(shù)據(jù)去除接頭以及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后分別獲得73 596 894～79 837 756個高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Clean reads），過濾后高質(zhì)量序列數(shù)占原始下機(jī)序列數(shù)的比例均大于97%，表明6 個樣品構(gòu)建的文庫質(zhì)量較好；同時，過濾后總序列中準(zhǔn)確率在99.9% 以上的堿基總數(shù)比例（Q30%）占95%以上，進(jìn)一步說明測序結(jié)果質(zhì)量較好。以上結(jié)果表明，本試驗構(gòu)建的泰州鵝6 個肝臟組織轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量好，可用于進(jìn)一步試驗，保證了后續(xù)研究的可靠性。

表 2 樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理評價分析Table 2 Quality evaluation and analysis on data preprocessing

2.2 測序數(shù)據(jù)比對分析

基因覆蓋數(shù)指每個基因上的 reads 覆蓋的堿基數(shù)跟基因編碼區(qū)所有堿基數(shù)的比值。將RNA-Seq 過濾后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Clean data）與參考基因組進(jìn)行比對分析，比對效率在88.61%～90.45%，多重覆蓋率在2.5%～3.1%（表3）。上述比對結(jié)果表明，本試驗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)利用率正常，所選用的參考基因組能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求。進(jìn)一步結(jié)合HISAT軟件對獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)比對分析，泰州鵝產(chǎn)蛋前、后肝臟組織的clean reads 依次分布于外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域和基因間區(qū)，其中外顯子區(qū)域分布最多（圖1）。上述比對結(jié)果表明，本試驗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)豐富性較好，能有效篩選差異基因。

圖 1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對基因區(qū)域分布統(tǒng)計Fig. 1 Transcriptome data vs. regional distribution of genes

2.3 差異基因篩選與驗證

結(jié)合FPKM 值定量估計所檢測的基因表達(dá)值，以開產(chǎn)前泰州鵝肝臟組織為對照，開產(chǎn)后泰州鵝肝臟組織為試驗組，獲得檢測基因的參考差異倍數(shù)（Fold change 值），進(jìn)一步篩選|log2Fold change|≥1（P＜0.05）的差異基因作為顯著差異基因，根據(jù)差異基因的Fold change 對數(shù)值以及統(tǒng)計學(xué)顯著程度繪制火山圖（圖2），以進(jìn)一步獲得開產(chǎn)前后泰州鵝肝臟組織差異基因表達(dá)水平的分布情況。最終篩選出202 個差異基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因100 個，下調(diào)差異表達(dá)基因102 個。

圖 2 差異表達(dá)基因火山圖Fig. 2 Volcano plot of differentially expressed genes

對上述篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析（圖3），開產(chǎn)前、后泰州鵝肝臟組織的3 個生物學(xué)重復(fù)各自聚類到了一起，而不同時間點的基因表達(dá)模式則出現(xiàn)分離，表明本試驗所用樣本生物學(xué)重復(fù)性較好，且樣本的分組也較為合理。

圖 3 差異表達(dá)基因熱圖聚類分析Fig. 3 Heat map of differentially expressed genes

為進(jìn)一步了解每個差異表達(dá)基因的功能，通過En-semble、NCBI 以及Uniprot 數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行綜合注釋，獲得差異表達(dá)基因的詳細(xì)描述信息。篩選泰州鵝開產(chǎn)前后肝臟組織差異基因表達(dá)最顯著的TOP10 基因進(jìn)行說明，結(jié)果見表4。為檢驗轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因的表達(dá)量是否準(zhǔn)確，隨機(jī)篩選上述10 個差異表達(dá)基因中的CHRNA9、SLC13A5、MRAP、EPSTI1和TLDC2等5 個基因，并以β-actin為內(nèi)參基因來進(jìn)行qRT-PCR驗證。qRTPCR 結(jié)果顯示，上述5 個基因的表達(dá)規(guī)律與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的表達(dá)規(guī)律基本一致。所以轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可信，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析（圖4）。

圖 4 開產(chǎn)前后泰州鵝肝臟組織相關(guān)基因表達(dá)檢測Fig. 4 Expressions of related genes in liver of Taizhou geese before and after start of egg-laying

表 3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組比對結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Results of clean reads on sample vs. reference genome

2.4 差異基因GO 功能富集分析

為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，通過GO（Gene Ontology，基因本體）數(shù)據(jù)庫對篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能富集分類，包括細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、生物過程（Biological process，BP）以及分子功能（Molecular function，MF）3 個方面（圖5）。202 個顯著差異基因進(jìn)行GO 功能注釋后，上述3 個功能分別被區(qū)分為5、18 和9 個功能亞類，共計42 個類別，詳情如圖4 所示。在CC 功能中，兩組間的差異表達(dá)基因在細(xì)胞結(jié)構(gòu)（Cell part）與膜結(jié)構(gòu)（Membrane part）中所占比例最大；在BP 功能中，細(xì)胞過程（Cellular process）與生物調(diào)控（Biological regulation）富集到的差異基因數(shù)目最多。在MF 功能中，差異基因在結(jié)合功能（Binding）中所占的比例最高，催化活性（Catalytic activity）次之。

表 4 泰州鵝開產(chǎn)前、后肝臟組織上調(diào)/下調(diào)差異最大的前10 位基因Table 4 Top 10 upregulated and downregulated genes in Taizhou geese before and after start of egg-laying

2.5 差異基因KEGG 通路注釋

為深入解析差異基因在泰州鵝開產(chǎn)前、后肝臟細(xì)胞活動過程中的作用，通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）的信號通路數(shù)據(jù)庫對篩選獲得的差異基因進(jìn)行通路注釋分析（P≤0.05），共獲得202 個差異表達(dá)基因富集的信號通路，以差異富集值（Rich ratio≥1）進(jìn)行篩選，共獲得顯著性富集的63 條差異信號通路（圖6），文中列舉出富集后最顯著的前5 個通路以作示例說明（表5），包括：藥物代謝-細(xì)胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450）信號通路、氮代謝（Nitrogen metabolism）信號通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（Pentose and glucuronate interconversion）信號通路、視黃醇代謝（Retinol metabolism）信號通路以及類固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）信號通路。

表 5 泰州鵝開產(chǎn)前、后肝臟組織富集顯著性最顯著的前5 條通路Table 5 Top 5 enriched pathways in liver of Taizhou geese before and after start of egg-laying

圖 5 差異表達(dá)基因GO 注釋Fig. 5 GO annotation on differentially expressed genes

圖 6 KEGG 富集分析Fig. 6 KEGG enrichment on differentially expressed genes

3 討論與結(jié)論

肝臟是禽類脂質(zhì)合成的主要場所，約有超過90% 的脂肪是在禽類肝臟中合成的[19]。在性成熟時，家禽的肝臟會發(fā)生許多代謝活動以支持卵黃發(fā)生；在產(chǎn)蛋時期，家禽的肝臟脂質(zhì)代謝活動會變得極為活躍，主要合成分泌極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein y, VLDLy）、 中 密 度 脂 蛋 白（Intermediate density lipoprotein, IDL）以及低密度脂蛋 白（Low density lipoprotein, LDL）[20?22]。其 中，VLDLy 可以直接到達(dá)卵母細(xì)胞的質(zhì)膜中，通過膜上受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入到卵母細(xì)胞，最終被卵母細(xì)胞吸收沉積，形成卵黃[23]。除此之外，肝臟也是生物機(jī)體最大、功能較多的腺體器官，參與膽汁分泌、激素合成等多項生理活動[24]。

轉(zhuǎn)錄組測序簡稱為RNA-Seq 技術(shù)，主要研究某一時間段內(nèi)特定細(xì)胞在一種功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有RNA 的總和，是研究基因遺傳圖譜以及蛋白質(zhì)生物信息功能的重要方法[18]。本研究通過RNA-Seq 技術(shù)對開產(chǎn)前、后的泰州鵝肝臟組織進(jìn)行了差異表達(dá)基因篩選，并對其中的5 個基因進(jìn)行了qRT-PCR 驗證。上述篩選并驗證的基因中，部分基因已有相關(guān)報道表明參與肝臟的脂質(zhì)代謝過程。黑皮質(zhì)素受體輔助蛋白（Melanocortin receptor accessory protein,MRAP）屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，是一種含有跨膜域的小蛋白，影響著動物的生長、發(fā)育和代謝過程[25]。雌激素與雞肝臟脂肪代謝過程密切相關(guān)，任俊曉等[26]研究表明，雞肝臟中MRAP 的表達(dá)受到雌激素的調(diào)控，是雌激素在肝臟的重要靶基因之一。SLC13A5（Solute carrier family 13 member 5）是溶質(zhì)載體家族成員，是一種鈉偶聯(lián)轉(zhuǎn)運蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞對檸檬酸的吸收，從而脂肪酸和膽固醇合成中發(fā)揮著重要作用[27]，小鼠SLC13A5 基因的敲除可有效抑制肝臟脂質(zhì)的從頭合成過程[28]。

在qRT-PCR 驗證確保了測序結(jié)果可靠性的基礎(chǔ)上，本試驗結(jié)合GO 數(shù)據(jù)庫對差異基因主要參與的生物學(xué)過程進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞過程以及結(jié)合功能等生物學(xué)過程。泰州鵝的開產(chǎn)意味著其已經(jīng)開始性成熟并發(fā)生著其他重要的生理變化，肝臟是性成熟的重要因素。本試驗通過差異基因GO 富集得到42 個生物學(xué)功能，綜合分布于細(xì)胞組分、生物過程以及分子功能3 個亞類，由此可以看出，開產(chǎn)后泰州鵝的肝臟在生殖激素的刺激下發(fā)生了許多生理性和代謝變化，以適應(yīng)自身生殖功能（產(chǎn)蛋）的需求。其中，生物過程中富集到了生殖過程與泰州鵝的產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)，其在肝臟中的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

為進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因功能，本試驗繼續(xù)結(jié)合KEGG 富集分析，篩選出65 個差異表達(dá)基因顯著富集的信號通路，列舉富集后最顯著的前5 個通路，包括藥物代謝-細(xì)胞色素P450 信號通路、氮代謝信號通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化信號通路、視黃醇代謝信號通路以及類固醇激素生物合成信號通路。其中，視黃醇代謝信號通路參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、生殖生理等過程。視黃醇是維生素A 的活性衍生物，視黃醇在體內(nèi)被進(jìn)一步氧化為視黃酸（Retinoic Acid, RA）[29]，在生物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散并到達(dá)細(xì)胞核，組織中RA 的表達(dá)水平與視黃酸代謝酶細(xì)胞色素P450 密切相關(guān)[30]，進(jìn)一步表明RA 影響畜禽的生殖系統(tǒng)功能，尤其在減數(shù)分裂啟動和性別分化中起到重要作用[31]。本試驗篩選出的Top 5 信號通路中同時包含了藥物代謝-細(xì)胞色素P450 信號通路和視黃醇代謝信號通路，表明在泰州鵝的開產(chǎn)期，上述2 條通路可能在肝臟中發(fā)揮著協(xié)同作用，是否參與此階段泰州鵝的生殖調(diào)控過程還有待進(jìn)一步驗證。類固醇激素包括雌二醇、睪酮、黃體酮等，脂肪水解形成的膽固醇是類固醇激素形成的原材料，有研究表明類固醇激素能通過黃體類固醇激素受體直接參與生殖系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)過程[32]，可以調(diào)控卵泡生長，包括排卵前卵泡的發(fā)育和排卵[5]，這些功能也應(yīng)征了本試驗篩選出的類固醇激素生物合成信號通路。綜上所述，參與泰州鵝開產(chǎn)前后肝臟組織脂質(zhì)代謝以及生殖過程相關(guān)的信號通路相互交織，組成了一個龐大復(fù)雜的細(xì)胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，其具體的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本試驗選取開產(chǎn)前、后泰州鵝肝臟組織進(jìn)行RNA-Seq 測序分析，初步篩選出10 個差異表達(dá)基因以及5 條信號通路，可能參與泰州鵝開產(chǎn)前后肝臟的脂質(zhì)代謝以及生殖過程調(diào)控。試驗結(jié)果豐富了與泰州鵝開產(chǎn)相關(guān)的肝臟組織功能分析，為進(jìn)一步研究泰州鵝肝臟的產(chǎn)蛋調(diào)控以及加速泰州鵝地方種群的進(jìn)一步選育提供了新的數(shù)據(jù)支撐。