文海若，顏玉靜，王曼虹，趙婷婷，楊瑩，馬雙成，汪祺

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心/藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

蓼科植物何首烏與人參、靈芝和冬蟲夏草并稱“四大仙草”。作為臨床常用補(bǔ)益良藥，何首烏被廣泛用于藥品和保健品中，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中已收錄近50個(gè)何首烏成方制劑[1]。近年來(lái)何首烏相關(guān)的臨床毒副作用報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，何首烏引起的藥源性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)病例數(shù)在全部中藥肝損傷中居首位[2]，其毒性作用研究在學(xué)界受到重視。何首烏的主要化學(xué)成分包括二苯乙烯苷類、蒽醌類、蒽酮類及磷脂類等。有學(xué)者提出“蒽醌致毒”的觀點(diǎn)[3-4]，并指出游離蒽醌(大黃素、大黃酚、大黃酸等)是何首烏的主要毒性成分，其作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響肝臟代謝酶功能、干擾膽汁酸分泌等。而蒽酮類在何首烏藥材中總體含量較高，但相關(guān)毒理學(xué)研究報(bào)道較少。雖單一蒽酮類成分在何首烏中含量不高，但多種二蒽酮可經(jīng)不同生化通路轉(zhuǎn)化為大黃素型單蒽酮(monanthrone with emodin type)。本課題組前期研究結(jié)果顯示二蒽酮及蒽酮糖苷類成分可誘導(dǎo)肝毒性，且其作用機(jī)制與抑制膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)活性并使膽紅素代謝障礙有關(guān)[5]。因該類物質(zhì)均具有相同母核，多種蒽酮類化合物均可經(jīng)不同體內(nèi)代謝通路轉(zhuǎn)化為單蒽酮，故有必要就其毒性作用風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[6]。

彗星電泳，又稱單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是在單細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)受試物導(dǎo)致DNA鏈損傷風(fēng)險(xiǎn)的經(jīng)典毒性評(píng)價(jià)方法[7]。人源肝細(xì)胞HepaRG具有類似肝臟祖細(xì)胞的分化能力，可以分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。因其表達(dá)豐富的Ⅰ相代謝酶(如CYP1A2、2B6、2C9、2E1、3A4)、Ⅱ相代謝酶(如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶)及多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP)等功能蛋白，適用于藥代動(dòng)力學(xué)研究和毒性代謝產(chǎn)物的篩選[8]。本研究分別使用HepaRG構(gòu)建的2D、3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型和大鼠體內(nèi)重復(fù)給藥體系開(kāi)展彗星實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)單蒽酮的毒性風(fēng)險(xiǎn)，探討不同模型對(duì)單蒽酮毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的影響。

1 材料

1.1 儀器與耗材

GravityPlusTM型和GravityTRAPTM型懸滴板(Insphero公司)；5180R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；NTS-1300型恒溫振蕩水槽(東京理化器械株式會(huì)社)；DYCP-31F型和DYY-6C型電泳儀電源(北京市六一儀器廠)；Nikon eclipse 80i型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Komet 6.0圖像分析系統(tǒng)(英國(guó)安道爾科技有限公司)。

1.2 試藥

大黃素型單蒽酮(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，純度≥95%，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；甲磺酸乙酯(EMS)、絲裂霉素C(MMC)、二甲基亞砜(DMSO)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，Sigma-Aldrich公司；Trevigen Comet Assay?Kit彗星檢測(cè)試劑盒(Trevigen公司)；Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，Cellgro公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；1%青鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液、SYBR Green I核酸凝膠染液(Life Technologies公司)；無(wú)水甲醇、無(wú)水乙酸(北京化工廠)；胎牛血清(FBS，Gibco公司)。

圖1 大黃素型單蒽酮結(jié)構(gòu)式

1.3 細(xì)胞

HepaRG細(xì)胞購(gòu)自Fisher Scientific公司，本研究所用細(xì)胞為第11～12代。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，給藥時(shí)約5～6周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXX(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的大鼠籠具內(nèi)，飼養(yǎng)密度為2～3只/籠。換氣給予鈷60放射滅菌的鼠全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。大鼠飼養(yǎng)于恒溫(20～26℃)、恒濕(40%～70%)的條件下，明暗周期為12 h，每小時(shí)最低換氣次數(shù)15次。研究方案通過(guò)國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)(IACUC)的倫理審查。

2 方法

2.1 基于2D細(xì)胞培養(yǎng)的彗星實(shí)驗(yàn)

調(diào)整HepaRG細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 mL培養(yǎng)液/細(xì)胞混合液，置37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h。細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，更換含0.5%DMSO(對(duì)照組)、EMS 2 μg·mL-1(陽(yáng)性對(duì)照組)及不同質(zhì)量濃度的單蒽酮(0.01、0.10、1.00、10.00 μg·mL-1)培養(yǎng)液處理24 h。每組平行3孔。所用質(zhì)量濃度根據(jù)課題組前期細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)設(shè)置[半數(shù)抑制濃度(IC50)為1 μg·mL-1][9]。收獲細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。樣本經(jīng)制片、裂解、解旋、電泳、中和、脫水等步驟后制備成單細(xì)胞凝膠標(biāo)本[10]。

2.2 基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的彗星實(shí)驗(yàn)

3D懸滴培養(yǎng)模型的制備方法參考王培昌等[7]使用的方法。模型在接種后的第4天將肝微組織轉(zhuǎn)移到Gravity TRAPTM板培養(yǎng)7 d，給予不同質(zhì)量濃度的單蒽酮(0.1、1.0、10.0 μg·mL-1)，所用質(zhì)量濃度根據(jù)前期細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)設(shè)置(IC50為1～10 μg·mL-1)[9]。同時(shí)設(shè)對(duì)照組(0.5% DMSO)和陽(yáng)性對(duì)照組(EMS 6 μg·mL-1)。每組平行使用3個(gè)微組織。連續(xù)給藥3次，每次48 h。細(xì)胞收獲及后續(xù)步驟同2.1項(xiàng)下。

2.3 大鼠體內(nèi)重復(fù)給藥彗星實(shí)驗(yàn)

2.3.1分組與給藥 25只雄性大鼠分設(shè)對(duì)照組(0.5% CMC-Na)、陽(yáng)性對(duì)照組(EMS 200 mg·kg-1)及單蒽酮6.5、65.0、650.0 mg·kg-1組，每組5只。最大給藥劑量根據(jù)單蒽酮于0.5% CMC-Na最大可重懸濃度和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定。對(duì)照組和單蒽酮各劑量組大鼠連續(xù)14 d口灌胃給藥，給藥體積為15 mL·kg-1。EMS組連續(xù)3 d灌胃給藥。

2.3.2觀察與體質(zhì)量檢測(cè) 給藥期間每天上午和下午隔籠觀察動(dòng)物是否存在死亡、瀕死，活動(dòng)狀況，外觀及被毛，有無(wú)外傷及糞便等情況；每周測(cè)定體質(zhì)量2次。解剖前禁食過(guò)夜。末次給藥3 h后所有動(dòng)物以CO2吸入法麻醉。

2.3.3堿性彗星實(shí)驗(yàn) 大鼠麻醉后由腹腔后大靜脈取血(50 μL/只)用于彗星實(shí)驗(yàn)。肝組織樣本采集肝左葉約2～3 mm3大小組織置于3 mL切碎液(含20 mmol·L-1EDTA-2Na和10% DMSO的HBSS溶液)中并使用剪刀剪碎組織以釋放細(xì)胞，經(jīng)40 μm濾膜濾過(guò)后置冰上備用。后續(xù)步驟同2.1項(xiàng)下。

2.3.4標(biāo)本檢測(cè) 所有標(biāo)本使用SYBR Green I(1∶10 000)染色，并在總放大倍數(shù)為200～400倍的熒光顯微鏡下拍照。使用Komet 6.0彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)本至少分析150個(gè)彗星細(xì)胞的尾DNA含量和Olive尾距(OTM)，并計(jì)算中位數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 2D模型彗星實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明，單蒽酮各質(zhì)量濃度組細(xì)胞尾DNA含量及OTM與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2)，即對(duì)HepaRG細(xì)胞DNA無(wú)明顯損傷作用。其中單蒽酮10.00 μg·mL-1組觀察到較多刺猬細(xì)胞，發(fā)生率為(75±4)%，當(dāng)刺猬細(xì)胞發(fā)生率超過(guò)50%時(shí)，大量凋亡細(xì)胞可對(duì)彗星觀察指標(biāo)產(chǎn)生影響，故單蒽酮10 μg·mL-1組細(xì)胞尾DNA含量和OTM數(shù)值反呈下降趨勢(shì)。

3.2 3D模型彗星實(shí)驗(yàn)

課題組前期已驗(yàn)證3D肝微組織中的白蛋白分泌水平和肝藥酶活性可維持至培養(yǎng)后10 d，實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)期的給藥[11]。不同質(zhì)量濃度單蒽酮與HepaRG細(xì)胞構(gòu)建的3D微組織共同作用144 h后，結(jié)果表明，當(dāng)單蒽酮質(zhì)量濃度為10.0 μg·mL-1時(shí)尾DNA含量及OTM[分別為(10.6±1.9)%和(1.0±0.2)%]與對(duì)照組[分別為(1.9±0.8)%和(1.0±0.2)%]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3，P<0.05，P<0.01)，且存在一定劑量相關(guān)性。

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001。圖2 單蒽酮2D肝細(xì)胞模型彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 單蒽酮3D肝組織模型彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 大鼠體內(nèi)重復(fù)給藥彗星實(shí)驗(yàn)

3.3.1癥狀與體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠未見(jiàn)異常表現(xiàn)，各組平均體質(zhì)量隨周齡增長(zhǎng)呈平穩(wěn)增長(zhǎng)趨勢(shì)(見(jiàn)圖4)。各組大鼠末次體質(zhì)量均有所下降，與剖檢取材前禁食過(guò)夜有關(guān)。故SD大鼠連續(xù)14 d給予單蒽酮650.0 mg·kg-1未見(jiàn)明顯毒性。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。圖4 單蒽酮對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

3.3.2體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，單蒽酮650.0 mg·kg-1劑量組大鼠肝細(xì)胞尾DNA含量及OTM[分別為(9.4±3.9)%和(0.9±0.5)%]均顯著高于對(duì)照組[分別為(2.2±0.5)%和(0.2±0.0)%，見(jiàn)圖5，P<0.01]，且各劑量組之間存在一定劑量效應(yīng)趨勢(shì)。而各單蒽酮給藥組大鼠的外周血有核細(xì)胞的尾DNA含量及OTM與對(duì)照組比較則未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明單蒽酮對(duì)肝臟細(xì)胞的DNA損傷程度強(qiáng)于外周血細(xì)胞，或與單蒽酮在肝臟中的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的毒性更強(qiáng)有關(guān)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001。圖5 單蒽酮SD大鼠外周血和肝細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

單蒽酮為本課題組首次從何首烏中分離出的單體化合物[12]，其在何首烏藥材中的含量可隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)而升高。此外，體內(nèi)存在多條生化通路可將不同蒽酮類化合物代謝為單蒽酮[6]。以研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的毒性預(yù)測(cè)軟件Derek Nexus(Version 6.0.1，Lhasa Limited，UK)未檢出其包括肝毒性警示結(jié)構(gòu)，其肝毒性風(fēng)險(xiǎn)研究尚不充分。本課題組在前期完成的連續(xù)14 d單蒽酮經(jīng)口給藥大鼠毒性研究中發(fā)現(xiàn)，單蒽酮可導(dǎo)致大鼠肝臟匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝臟γ干擾素(IFN-γ)的水平顯著下降，提示其具有一定肝臟毒性作用[13]。使用HepaRG細(xì)胞制備2D和3D培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)單蒽酮毒性，并發(fā)現(xiàn)大黃素型單蒽酮經(jīng)代謝后毒性降低，并可誘導(dǎo)Ⅰ相代謝酶CYP3A4和CYP2B6的表達(dá)量升高和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P糖蛋白(P-gp)和MRP2的上調(diào)，可見(jiàn)單蒽酮的毒性與其在體內(nèi)的代謝和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[9]。本研究比較了體內(nèi)及體外評(píng)價(jià)模型中單蒽酮的肝毒性特點(diǎn)，在2D肝細(xì)胞模型未見(jiàn)DNA損傷作用，但可誘導(dǎo)3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型和大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)DNA斷裂。連續(xù)14 d給予大鼠單蒽酮650.0 mg·kg-1可對(duì)肝臟細(xì)胞產(chǎn)生一定損傷。值得注意的是，大鼠外周血樣本中則未見(jiàn)給予單蒽酮誘導(dǎo)的DNA斷裂，提示毒性的產(chǎn)生與肝細(xì)胞及組織的代謝密不可分。

單蒽酮母核蒽酮結(jié)構(gòu)與蒽醌結(jié)構(gòu)有一定相似性，且可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為蒽醌類大黃素。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠口服給予大黃素型單蒽酮后，可在大鼠血液及肝臟組織中檢出單體大黃素、蘆薈大黃素型葡萄糖醛酸結(jié)合物及大黃素型單蒽酮的氧化物。其中大黃素的肝毒性和DNA斷裂風(fēng)險(xiǎn)已有諸多報(bào)道[14-15]。故單蒽酮誘導(dǎo)的肝臟毒性可能主要與其代謝產(chǎn)物有關(guān)，抑制其代謝通路或可有效減毒，該推論有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

彗星實(shí)驗(yàn)是常用的體外及體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)方法，可較為靈敏地預(yù)測(cè)受試物對(duì)細(xì)胞核和DNA堿基的損傷作用。體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)更作為重復(fù)給藥毒性研究的一部分可對(duì)不同臟器的代謝產(chǎn)物毒性進(jìn)行評(píng)估[16]。課題組前期已驗(yàn)證了體外3D肝組織彗星實(shí)驗(yàn)體系對(duì)毒性預(yù)測(cè)效果優(yōu)于2D評(píng)價(jià)模型，本研究中證實(shí)3D培養(yǎng)組織中的研究結(jié)果與體內(nèi)研究結(jié)果更具可比性，再次凸顯3D肝臟培養(yǎng)模型在未來(lái)肝毒性評(píng)價(jià)應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究首次通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)比驗(yàn)證單蒽酮的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)并非原型化合物而是其代謝產(chǎn)物，可為何首烏質(zhì)量控制和合理用藥提供參考。3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型在肝毒性預(yù)測(cè)方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，今后可進(jìn)一步結(jié)合多種肝藥酶表達(dá)檢測(cè)及細(xì)胞因子等指標(biāo)，系統(tǒng)地開(kāi)展單蒽酮及多種蒽酮類化合物毒性作用通路研究。