王燦紅，彭德乾，劉洋洋，余章昕，郭鵬，3*，魏建和，3*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所 海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點實驗室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點研究室，海南 海口 570311；2.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193

國產(chǎn)沉香為白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.含樹脂的木材，是名貴南藥，為中醫(yī)臨床常用理氣藥。沉香藥用已有千余年歷史，有“藥中黃金”之稱。沉香味辛、苦，性微溫，《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版收錄其功效為“行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘”[1]。歷代本草記載沉香可止嘔，五代吳越《日華子本草》記載沉香可調(diào)中、補(bǔ)五臟、益精、壯陽、暖腰膝、止吐瀉、心腹痛和氣痢等[2]。明代陳嘉謨《本草蒙筌》記載沉香抑陰助陽，轉(zhuǎn)筋吐瀉能止，噤口痢痛可驅(qū)，散滯氣[3]。中醫(yī)臨床廣泛將其用于治療胸腹脹悶疼痛[4]、胃寒呃逆嘔吐[5]、腎虛氣逆喘急[6]等證。現(xiàn)有臨床研究顯示，沉香復(fù)方制劑降逆湯[7]、沉香粉[8]、山楂沉香散[9]、止嘔神貼[10]用于治療卒中頑固性呃逆、惡性腫瘤化療及術(shù)后所致嘔吐，均有較好療效，因此推測沉香具有溫胃散寒、降逆和胃、溫中止嘔的作用。目前沉香防治嘔吐的作用及機(jī)制尚未得到闡釋。因此，本研究采用順鉑(DDP)制備家鴿嘔吐模型，評價沉香醇提物的止嘔作用并初步探究其可能的作用機(jī)制，為沉香止嘔的深入研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

通體結(jié)香技術(shù)[11]產(chǎn)沉香(簡稱通體沉香)原料購自廣東化州沉香結(jié)香種植基地，野生沉香和火烙沉香均購自廣東化州，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所魏建和研究員鑒定均為白木香A.sinensis(Lour.)Gilg.產(chǎn)沉香。

沉香醇提物參考文獻(xiàn)方法制備[12]，所得通體沉香、野生沉香和火烙沉香醇提物浸出率分別為14%、10.5%和14%。根據(jù)《中國藥典》2015年版[1]規(guī)定方法，分別對不同來源沉香制備的醇提物通過高效液相色譜進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)控檢測。

1.2 實驗動物

健康家鴿48只，體質(zhì)量300～400 g，購自北京芳元緣養(yǎng)殖場，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0012。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所清潔級動物房，使用許可證號：SYXK(京)2017-0039，動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實驗。

1.3 試劑

DDP(貨號：232120，Sigma公司)；陽性藥物甲氧氯普胺片(批號：G170101，山西云鵬制藥有限公司)；5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)試劑盒(北京博勝經(jīng)緯科技有限公司)；甲醛、0.9%氯化鈉溶液等分別為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器

Labofuge 400R型離心機(jī)(德國Heraeus公司)；MQX 200型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)；CKX 41型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；動物電子稱、秒表計時器等。

2 方法

2.1 嘔吐模型制備及給藥

健康家鴿隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥甲氧氯普胺組(50 mg·kg-1)、野生沉香醇提物組(相當(dāng)于生藥2.84 g·kg-1)、火烙沉香醇提物組(相當(dāng)于生藥2.84 g·kg-1)及通體沉香醇提物低、中、高劑量(相當(dāng)于生藥0.71、1.42、2.84 g·kg-1)組。對照組和模型組家鴿灌胃給予等體積蒸餾水，陽性藥物和受試藥物組分別灌胃給予相應(yīng)藥物20 mL·kg-1，連續(xù)給藥7 d。參考文獻(xiàn)方法制備家鴿嘔吐模型，通過預(yù)實驗最終確定造模劑量[13]。末次給藥1 h后，除對照組外，其余各組家鴿分別腹腔注射DDP 6 mg·kg-1、10 mL·kg-1制備嘔吐模型，并進(jìn)行藥效指標(biāo)評價。

2.2 嘔吐潛伏期

家鴿腹腔注射DDP制備嘔吐模型后，觀察并記錄從注射后到第一次出現(xiàn)嘔吐的時間，即為嘔吐潛伏期。

2.3 嘔吐次數(shù)及嘔吐頻率

家鴿腹腔注射DDP制備嘔吐模型后，連續(xù)觀察并分別記錄0～2、2～4、4～6 h內(nèi)的嘔吐次數(shù)，根據(jù)公式(1)計算嘔吐頻率。

嘔吐頻率=6只家鴿6 h內(nèi)嘔吐的總次數(shù)/6/6

(1)

2.4 胃腺組織病理損傷觀察

造模24 h后，翅靜脈取血，解剖家鴿，摘取胃腺組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，按照常規(guī)病理切片方法脫水，石蠟包埋，5 μm切片，蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡(×100)下，觀察胃腺組織血管擴(kuò)張出血、炎性細(xì)胞浸潤、胃腺細(xì)胞脫落及壞死等。按照以下評分標(biāo)準(zhǔn)計算胃腺組織的損傷程度：胃腺組織血管擴(kuò)張出血(0～3分)、胃腺細(xì)胞脫落壞死(0～4分)及炎癥細(xì)胞浸潤(0～3分)，每部分損傷評分的總和作為該組織的損傷程度。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清中5-HT和DA水平

造模24 h，家鴿翅靜脈取血后，3000 r·min-1離心15 min(離心半徑11 cm)，取上清，置于-20 ℃凍存。按照試劑盒說明書操作方法，檢測5-HT和DA水平。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 沉香醇提物特征圖譜及特征成分沉香四醇含量測定

不同來源沉香醇提物的特征圖譜顯示，通體沉香、野生沉香及火烙沉香醇提物中均含有《中國藥典》2015年版規(guī)定的6個特征性成分，且沉香四醇含量達(dá)到《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。圖中1號峰為沉香四醇，經(jīng)計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.21%、0.11%和0.22%，見圖1A～C。

注：A.通體沉香醇提物；B.野生沉香醇提物；C.火烙沉香醇提物。圖1 不同來源沉香醇提物的特征圖譜

3.2 沉香醇提物對家鴿嘔吐潛伏期的影響

與模型組比較，陽性藥甲氧氯普胺和通體沉香醇提物高劑量能夠顯著延長家鴿的嘔吐潛伏期(P<0.05，P<0.01)，且通體沉香醇提物高劑量組作用與陽性藥相當(dāng)，優(yōu)于同劑量下的野生沉香醇提物和火烙沉香醇提物，見圖2。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，圖3～4同。圖2 沉香醇提物對家鴿嘔吐潛伏期的影響

3.3 沉香醇提物對家鴿嘔吐次數(shù)的影響

與模型組比較，在造模后0～2、4～6 h，陽性藥甲氧氯普胺和通體沉香醇提物可顯著降低家鴿的嘔吐次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，且4～6 h通體沉香醇提物高劑量效果最顯著，優(yōu)于陽性藥、野生沉香醇提物和火烙沉香醇提物；其中2～4 h時，各受試藥物也可降低家鴿嘔吐次數(shù)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖3 沉香醇提物對家鴿嘔吐次數(shù)的影響

3.4 沉香醇提物對家鴿嘔吐頻率的影響

與模型組比較，陽性藥和各受試藥物均可降低家鴿嘔吐頻率，其中甲氧氯普胺和通體沉香醇提物高劑量可顯著降低家鴿嘔吐頻率(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，且通體沉香醇提物高劑量作用優(yōu)于陽性藥和同劑量下的野生沉香及火烙沉香醇提物，見圖4。

圖4 沉香醇提物對家鴿嘔吐頻率的影響

3.5 沉香醇提物對家鴿胃腺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

胃腺組織病理切片結(jié)果顯示(見圖5)，對照組家鴿胃腺組織結(jié)構(gòu)清晰，胃上皮細(xì)胞排列整齊，大小均一，無血管擴(kuò)張、出血及細(xì)胞壞死等病理變化，且未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。模型組家鴿胃腺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，血管擴(kuò)張伴嚴(yán)重出血，大面積胃細(xì)胞壞死，可見大量炎細(xì)胞浸潤。而甲氧氯普胺、野生沉香、火烙沉香和通體沉香醇提物均能夠不同程度緩解胃腺組織的病理損傷，其中通體沉香醇提物高劑量組的效果最好，胃上皮細(xì)胞壞死、出血及炎癥細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象均顯著減輕；陽性藥作用次之，野生沉香醇提物和通體沉香醇提物中劑量組效果相當(dāng)，較好地改善了胃腺組織的病理損傷，火烙沉香醇提物與通體沉香醇提物低劑量組效果相當(dāng)，其中仍可見胃腺組織損傷現(xiàn)象，胃腺上皮細(xì)胞仍有輕度出血和少量炎癥細(xì)胞浸潤，但細(xì)胞壞死顯著減少。

注：A.對照組；B.模型組；C.甲氧氯普胺50 mg·kg-1組；D.野生沉香醇提物2.84 g·kg-1組；E.火烙沉香醇提物2.84 g·kg-1組；F.通體沉香醇提物0.71 g·kg-1組；G.通體沉香醇提物1.42 g·kg-1組；H.通體沉香醇提物2.84 g·kg-1組；I.病理損傷分?jǐn)?shù)；與對照組比較，***P<0.001；與模型組比較，圖5 沉香醇提物對家鴿胃腺組織病理形態(tài)學(xué)及病理損傷分?jǐn)?shù)的影響(HE，×100)

3.6 沉香醇提物對家鴿血清中5-HT和DA水平的影響

與對照組比較，模型組家鴿血清中5-HT和DA水平顯著升高(P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，甲氧氯普胺和各沉香醇提物均能夠不同程度降低致嘔神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，通體沉香醇提物作用呈現(xiàn)劑量依賴性，且高劑量作用優(yōu)于同等劑量下野生沉香和火烙沉香醇提物，見圖6。

4 討論

嘔吐是臨床常見且難以治療的一種癥狀，中醫(yī)臨床胃腸道病證表現(xiàn)為胃中氣滯則胃脘脹痛，氣滯上逆則惡心、嘔吐[14]；西醫(yī)中迷走神經(jīng)刺激性疾病、胃腸道疾病、外科手術(shù)及腫瘤放、化療等均可誘發(fā)惡心、嘔吐，其中腫瘤放、化療副作用嘔吐最常見且發(fā)生率高，如DDP所致嘔吐率高達(dá)90%～100%[15]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療效果。本研究采用腹腔注射DDP制備家鴿嘔吐模型，評價沉香醇提物的止嘔作用并對其作用機(jī)制進(jìn)行初探。結(jié)果顯示，沉香醇提物可顯著抑制家鴿的嘔吐反應(yīng)，作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌有關(guān)。

化療嘔吐是指化療藥物導(dǎo)致胃腸黏膜損傷、胃腸動力障礙或刺激胃腸道的嗜鉻細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放5-HT、DA等神經(jīng)遞質(zhì)和其受體結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)沖動，傳入嘔吐中樞誘發(fā)嘔吐[16-17]。中醫(yī)理論亦認(rèn)為，化療藥物可直中脾胃，導(dǎo)致脾胃虛弱、升降失常而出現(xiàn)惡心嘔吐、臟腑脹滿等癥狀[13，18]。甲氧氯普胺為多巴胺D2受體拮抗劑，同時對5-HT3受體也有輕度抑制作用，可作用于延髓催吐化學(xué)感受區(qū)(CTZ)中DA受體，具有強(qiáng)大的中樞鎮(zhèn)吐作用；對于胃腸道的作用主要在上消化道，促進(jìn)胃及上部腸段的運動、提高胃腸道括約肌張力、增加下食管括約肌張力和收縮幅度、阻滯胃-食管反流、加強(qiáng)胃和食管蠕動、促進(jìn)胃排空、協(xié)調(diào)胃及上部小腸的功能，這些作用均可增強(qiáng)其止嘔作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，陽性藥物甲氧氯普胺通過減少DA和5-HT釋放及產(chǎn)生胃腸黏膜保護(hù)作用發(fā)揮止嘔作用，與已有文獻(xiàn)報道相一致。前期課題組研究表明，通體沉香醇提物可促進(jìn)胃排空和腸推進(jìn)，還具有顯著抗胃潰瘍和腸炎作用[21-22]。此外，還發(fā)現(xiàn)通體沉香揮發(fā)油具有顯著鎮(zhèn)靜促眠、抗焦慮及抗抑郁作用，表現(xiàn)出較好的中樞神經(jīng)抑制作用；且作用機(jī)制與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)及其受體相互作用、抑制下丘腦-垂體-腎上腺素(HPA)軸及調(diào)節(jié)氨基酸、核酸和能量代謝有關(guān)[23-24]。這些發(fā)現(xiàn)均提示通體沉香可能通過促進(jìn)腸推進(jìn)、胃排空、保護(hù)胃黏膜及中樞神經(jīng)抑制發(fā)揮止嘔作用。本研究結(jié)果顯示，DDP可誘導(dǎo)家鴿嘔吐，模型制備成功，與已有研究報道一致[14，18]。通體沉香醇提物能劑量依賴性地延長家鴿的嘔吐潛伏期，減少嘔吐次數(shù)和嘔吐頻率，緩解DDP對家鴿胃組織的損傷，同時降低神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA的水平，發(fā)揮顯著止嘔作用，且作用優(yōu)于野生沉香和火烙沉香醇提物。課題組前期的沉香醇提物促進(jìn)胃排空、腸推進(jìn)，抗胃潰瘍及腸炎作用研究結(jié)果也顯示，通體沉香作用相近或優(yōu)于野生和火烙沉香醇提物。通過質(zhì)控的結(jié)果可知，本研究所用受試藥物的品質(zhì)及穩(wěn)定性可控，且均達(dá)到《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)，醇提物也通過同樣的提取制備方法。而藥效存在差異，推測可能原因是不同結(jié)香方法所得沉香的成分存在差異，野生沉香形成需要較長時間，相同成香時間的活性成分種類和含量可能相對少，火烙沉香通過火燒鉆孔的方法，可能成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，而通體沉香是通過化學(xué)試劑誘導(dǎo)結(jié)香，且在短時間內(nèi)結(jié)香的品質(zhì)就可達(dá)到甚至超過《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)，相同成香時間可能活性成分種類和含量會更高，而且化學(xué)誘導(dǎo)可能會產(chǎn)生新的成分。這些均可能是通體沉香醇提物藥效優(yōu)于其他來源沉香的原因，但具體還需作進(jìn)一步研究闡釋。

綜上所述，通體沉香醇提物對DDP所致的家鴿嘔吐反應(yīng)具有顯著抑制作用，且通體沉香醇提物高劑量效果與陽性藥甲氧氯普胺作用相當(dāng)，優(yōu)于野生沉香和火烙沉香醇提物，可能的止嘔機(jī)制與調(diào)節(jié)致嘔神經(jīng)遞質(zhì)分泌、促進(jìn)胃腸蠕動及拮抗藥物所致胃腸功能障礙等有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待深入探究。