郝曉鳳，謝立科，胥靜，黃少蘭，金琪，孫梅，李曉宇，張小艷，王詩惠，吳改萍

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是以視網(wǎng)膜靜脈充血擴(kuò)張為特征的一類視網(wǎng)膜血管病，常繼發(fā)視網(wǎng)膜內(nèi)出血、水腫或缺血，當(dāng)黃斑水腫累及中心凹時，出現(xiàn)急性無痛性視力下降，分為視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和分支靜脈阻塞兩類[1]，是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的第二大致盲性視網(wǎng)膜血管病[2-4]。大量研究[5-7]證實，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是RVO 發(fā)生發(fā)展中最關(guān)鍵的因子，VEGF 可致血管通透性增加，加重血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞，引起視網(wǎng)膜出血、滲出及水腫，并加重組織缺氧；同時，缺氧可使缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducing factor 1α，HIF-1α）去羥基化、活性增加，又促進(jìn)VEGF 釋放，形成惡性循環(huán)。由此可見，HIF-1α/VEGF 通路參與了RVO 的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“絡(luò)損暴盲”“血證”范疇[2],中藥祛積通絡(luò)方在RVO 所致的黃斑水腫（macular edema，ME）的臨床治療中取得了較為顯著的效果[8]，理論上可以減輕眼底出血、水腫和滲出，修復(fù)視網(wǎng)膜微血管損傷。本研究通過光化學(xué)動力法建立大鼠RVO 模型，觀察祛積通絡(luò)方對實驗型RVO 大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGF mRNA 表達(dá)的影響，初步探討中藥治療RVO 眼底出血、水腫、滲出的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性BN 大鼠（購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SYXK（京）2014-0043）60 只，SPF 級，體重180～200 g，無眼疾。實驗動物及實驗所用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1儀器 眼底激光儀（德國海德堡公司）、眼底血管造影儀（德國海德堡公司）、切片機（美國Leica 公司）、PCR 儀（ABI 公司）、離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、電動勻漿機（FLUK）。

1.2.2試劑 復(fù)方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社）、鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥株式會社）、孟加拉紅和戊巴比妥鈉注射液（廣西梧州制藥有限公司）、熒光素鈉注射液（美國Alcon 公司）、SYBR Green PCR 試劑盒 （Thermo）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）、HIF-1α、VEGF 多克隆抗體（Abcam）。

1.3 實驗藥物

祛積通絡(luò)方由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地黃、茯苓、半夏、三七、陳皮、雞內(nèi)金、防風(fēng)組成，參考《藥理實驗方法學(xué)》[9]用量與濃度按有色鼠與人用藥量比進(jìn)行換算（MechRubner 公式），配制臨床等效劑量濃度1.0 g/L生藥。復(fù)方血栓通膠囊由廣西梧州制藥有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1RVO 動物模型的建立[10]BN 大鼠用10 g/L 戊巴比妥鈉按40 mg/kg 體質(zhì)量腹腔注射麻醉，右眼滴鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳10 min，3%孟加拉紅30 mg/kg 經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢注入0.25 ml。給藥3 min 后，大鼠角膜上安置滴加氧氟沙星眼膏的三面鏡，于伴行動脈距離較遠(yuǎn)的靜脈，從靜脈遠(yuǎn)端向視乳頭方向，采用波長532 nm 綠光進(jìn)行激光照射，遠(yuǎn)端血管變細(xì)后，可以增加參數(shù)照射近端血管，觀察血流完全中斷，則可形成1 個視盤直徑（disc diameter，DD）左右的靜脈血栓或阻塞，每支血管平均照射25～30 點，每只眼間隔選3 支靜脈血管建立RVO 模型。激光照射后大鼠避光12 h。激光治療參數(shù)：功率80～100 mW，光斑直徑50～100 μm，激光照射時間0.4～0.6 s 進(jìn)行血管照射。

1.4.2動物分組與處理 60 只BN 大鼠隨機分為6組，每組10 只。正?？瞻捉M（正常組）：不造模，正常喂養(yǎng)，自由飲水；模型組：造模成功后，按給藥組等量蒸餾水灌胃，每日1 次；陽性對照組（對照組）：造模成功后，將復(fù)方血栓通膠囊內(nèi)藥物溶于水中灌胃，根據(jù)人與大鼠按體表面積折算的等效劑量比值計算等效劑量[9]，確定給藥劑量為0.2 g/kg/d，每日1 次；祛積通絡(luò)低劑量組（低劑量組）、祛積通絡(luò)中劑量組（中劑量組）、祛積通絡(luò)高劑量組（高劑量組）：造模成功后，采用祛積通絡(luò)方灌胃給藥，給藥劑量經(jīng)計算后分別為0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L，每日1 次，每次2 ml。治療28 d。

1.5 眼底熒光血管造影檢查

于造模后1 h 隨機選取各組大鼠5 只，行眼底熒光血管造影（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）檢查，腹腔注射10 g/L 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，腹腔注射10%熒光素鈉注射液（0.1 ml/100 g），并立即用眼底照相機進(jìn)行觀察照相。并于造模后7 d，隨機取模型組大鼠5 只，觀察FFA 眼底相。

1.6 RT-PCR 檢測

觀察視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGF mRNA 的表達(dá)水平。各組分別于造模后1 h、28 d 處死大鼠，顯微鏡下去除眼前節(jié)、晶狀體、玻璃體，分離視網(wǎng)膜組織標(biāo)本。利用RNA 提取試劑盒步驟提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用Real-time PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 引物探針設(shè)計[11]見表1。PCR 反應(yīng)體系的配制（總體積25 μl）：SYBRGreen Mix 10 μl、上游引物和下游引物各1 μl、ddH2O 11 μl、cDNA 模板2 μl，總體積25 μl 置于擴(kuò)增程序。PCR 擴(kuò)增體系設(shè)置：95℃×10min（95℃×15s；55℃×45s）循環(huán)40 次；冷卻后再升溫至95℃×15s；60℃×1 min；95℃×15 s；60℃×15 s。60℃檢測信號。

表1 RT-PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型的鑒定及RVO 大鼠FFA 特征

空白組大鼠FFA 示視網(wǎng)膜血管呈放射狀走行，靜脈管徑均勻，充盈良好，未見熒光滲漏（圖1A）。各組造模后1 h，上方阻塞的靜脈無熒光顯示，靜脈粗細(xì)不均，箭頭處可見血流中斷，說明模型成功建立（圖1B）；模型組造模后7d，可見阻塞的靜脈迂曲擴(kuò)張，出血遮蔽，視網(wǎng)膜色素沉著，部分血管可再通（圖1C）。

圖1 各組大鼠FFA 圖像。1A 空白組；1B 各組造模后1 h，視網(wǎng)膜靜脈血流中斷，阻塞的靜脈無熒光顯示（紅箭頭）；1C 模型組造模后7 d，阻塞的靜脈迂曲擴(kuò)張，粗細(xì)不均，可見血管再通現(xiàn)象（紅箭頭）

2.2 視網(wǎng)膜組織中HIF-1α、VEGF mRNA 的表達(dá)

數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。各組溶解曲線均為單一型的曲線，沒有引物二聚體等非特異擴(kuò)增曲線，引物設(shè)計及反應(yīng)條件良好。

HIF-1α mRNA 表達(dá)：在正常組有微量表達(dá)，造模后其他組相對表達(dá)量均增加。造模后1 h，各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.489，P=0.088）。造模后28 d，對照組和低、中、高劑量組表達(dá)水平相對于模型組均下降，各組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.981，P=0.007）；低劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.541，P=0.597）；中、高劑量組與對照組比較，t中劑量組=3.071，P=0.037；t高劑量組=4.620，P=0.010；中、高劑量組之間比較，t=3.147，P=0.035，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

VEGF mRNA 表達(dá)：在正常組有微量表達(dá)，造模后其他組相對表達(dá)量均增加。造模后1 h，各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.327，P=0.055）。造模后28 d，對照組和低、中、高劑量組表達(dá)水平相對于模型組均下降，各組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.563，P=0.021）；對照組與三種劑量組比較，t低劑量組=3.221，P=0.032；t中劑量組=4.349，P=0.012；t高劑量組=5.689，P=0.005；低劑量組與中、高劑量組比較，t中劑量組=3.113，P=0.032；t高劑量組=7.612，P=0.001；中、高劑量組比較，t=5.805，P=0.005，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 HIF-1α mRNA 和VEGF mRNA 表達(dá)量RT-PCR 半定量分析（±s，n=5）

表2 HIF-1α mRNA 和VEGF mRNA 表達(dá)量RT-PCR 半定量分析（±s，n=5）

注：△與正常組比較，P＜0.05；# 與模型組比較，P＜0.05；* 與對照組比較，P＜0.05；HIF-1α 缺氧誘導(dǎo)因子1α；VEGF 血管內(nèi)皮生長因子

3 討論

RVO 發(fā)生機理有兩大學(xué)說，一是血栓形成學(xué)說[12-13]，一是靜脈功能性調(diào)節(jié)障礙[6,14-15]。后者由臨近的病變動脈或缺氧組織釋放血管收縮分子內(nèi)皮素（Endothelin-1，ET-1）和VEGF，引起血管收縮、組織缺血、代謝紊亂和細(xì)胞增殖等血管損傷，大量VEGF釋放致血管通透性增加，加重血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞，從而引起視網(wǎng)膜出血、滲出及水腫[16]。VEGF是公認(rèn)的RVO 發(fā)生中最關(guān)鍵的因子。VEGF 可促進(jìn)血管細(xì)胞粘附分子（vascularcelladhesionmole-1，VCAM-1）過量表達(dá)，進(jìn)一步介導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附作用增強，增多的VCAM-1 又可與中性粒細(xì)胞結(jié)合，隨著血流滾動于血管內(nèi)壁，最后粘附于血管表面，使白細(xì)胞停滯、血液流通受限，最終導(dǎo)致血栓形成或組織中的血供受限，從而損傷組織，加重視網(wǎng)膜缺血缺氧。同時，組織缺氧時，可使HIF-1α 去羥基化、活性增加，促進(jìn)VEGF、VCAM-1 等因子釋放，形成惡性循環(huán)[6,16]。因此，推測HIF-1α/VEGF 通路參與了RVO 疾病的發(fā)生與發(fā)展。

中醫(yī)認(rèn)為，RVO 的基本病機脈絡(luò)瘀阻，血外溢于目，“血瘀”是RVO 最突出的病機[17]。主要致病因素有情志內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)；肝腎陰虧、肝陽上亢；過食肥甘厚味、痰濕內(nèi)生[18]。課題組從“絡(luò)病”入手，認(rèn)為RVO 因邪犯目絡(luò)，絡(luò)中氣機阻滯，血行瘀滯，或痰凝津結(jié)、阻塞絡(luò)道，發(fā)為本病，在RVO 疾病發(fā)生發(fā)展中，氣、血、痰、瘀、水等病理因素往往相互纏綿共存一體，與眼底出血、水腫、滲出、缺血、新生血管形成等相對應(yīng)，因此，提出脈積理論，將本病病機歸為“絡(luò)損積阻”，治法以“祛積通絡(luò)”為主[19-20]。課題組前期臨床研究已證實，祛積通絡(luò)方可以有效緩解眼底出血、水腫，修復(fù)微血管損傷。因此，需要通過動物實驗進(jìn)一步探討中藥祛積通絡(luò)方治療RVO 的作用機理。

本研究采用光化學(xué)法制作大鼠RVO 動物模型，將光敏藥物孟加拉紅注入大鼠靜脈后，激光照射視網(wǎng)膜血管，在光敏藥物與照射激光的共同作用下形成RVO 模型[10]。在所有文獻(xiàn)報道的RVO 動物模型中，光化學(xué)法最容易在視網(wǎng)膜血管形成血栓，與其他造模方法相比，光化學(xué)法模型制作簡單、快速、重復(fù)性好，短時間內(nèi)即可制作成功，造成血小板聚集及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且模型動物存活時間長，為各種藥物研究提供了可能性。模型應(yīng)用光化學(xué)法時應(yīng)注意的是激光能量不宜過大，避免局部爆破作用擊破Bruch 膜直接形成脈絡(luò)膜新生血管 （choroidal neovascularization，CNV）；光斑直徑也不宜過大，防止損傷范圍過大[21]。但由于嚙齒類動物沒有黃斑，因此，大鼠RVO 模型不能模擬人類RVO 繼發(fā)黃斑水腫的模型，僅在血栓形成、視網(wǎng)膜出血、水腫、滲出及微環(huán)循功能受損等病理表現(xiàn)上有一致性。

本研究以復(fù)方血栓通膠囊作為陽性對照，研究[22]表明，復(fù)方血栓通膠囊可能降低視網(wǎng)膜新生血管中VEGF 的表達(dá)。本文發(fā)現(xiàn)中藥祛積通絡(luò)方中、高劑量組對HIF-1α、VEGF mRNA 有抑制作用，且在抑制HIF-1α、VEGF 蛋白的表達(dá)上，也得到類似的結(jié)果，說明中藥祛積通絡(luò)方可從轉(zhuǎn)錄水平抑制HIF-1α/VEGF，從而抑制RVO 疾病發(fā)展。

祛積通絡(luò)方中桃仁、紅花、當(dāng)歸、三七均具有抗凝血、抗血栓功能；紅花能抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，紅花、當(dāng)歸萃取液能阻止內(nèi)皮細(xì)胞過度增生，穩(wěn)定血管內(nèi)膜，且具有抗炎作用；當(dāng)歸對缺血損傷具有保護(hù)作用；三七有止血、補血功能；地黃具有止血、強心、利尿、降血糖、抗炎、保肝等作用；桃仁、當(dāng)歸、地黃均具有抗炎、抗自由基、抗腫瘤及增強免疫力等作用。陳皮具有抗血小板聚集、抗氧化作用；半夏有燥濕化痰，降逆止嘔，與雞內(nèi)金均有消痞散結(jié)之功效；茯苓具有抗菌抗炎抗病毒、利水消腫、抗腫瘤抗衰老以及調(diào)節(jié)免疫功能。防風(fēng)主要有抗炎、抗菌、抗腫瘤、提高機體免疫功能、抗過敏、抗凝血等藥理作用。以上藥物合用，不僅可增強止血、活血、改善微循環(huán)、防止血栓形成的作用；同時加入燥濕化痰，消痞散結(jié)，利水消腫諸藥，可促進(jìn)瘀血水腫吸收。因此，祛積通絡(luò)方治療RVO 模型大鼠不僅發(fā)揮了中藥多靶點治療優(yōu)勢，在經(jīng)濟(jì)學(xué)意義上也占優(yōu)勢。

本實驗動物模型視網(wǎng)膜血管的阻塞是在健康的血管床上光化學(xué)動力誘導(dǎo)而成的，而人RVO 患者年齡多在40 歲以上，多合并其他全身血管性疾病，如高血壓病、高脂血癥、糖尿病、高酮癥氨酸血癥等，有血管壁、血液流變學(xué)及血液動力學(xué)的改變。如果能在具有全身血管病變、出現(xiàn)代謝綜合征的動物中進(jìn)一步制作RVO 模型，可能更接近人的RVO 病理狀態(tài)。所以本動物模型實驗結(jié)論的合理性是相對的，需要通過逐步完善實驗，最終找到人體疾病發(fā)生的真正原因，找到更精準(zhǔn)的治療方案[21]。