金明蘭， 王悅宏， 郝新瑞， 李華南， 姚峻程， 胡 晶，孫赫陽(yáng)， 張 明， 徐瑩瑩， 孫世梅， 金寧一

(1.吉林建筑大松遼流域水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)春 130118； 2.吉林建筑大學(xué)事故預(yù)防研究院， 長(zhǎng)春 130118；3.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 濟(jì)南 250100； 4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)獸醫(yī)研究所， 長(zhǎng)春 130022)

近年來(lái)，由于制藥業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素現(xiàn)象日趨增多，大多數(shù)抗生素以代謝產(chǎn)物的形式和未變化的形態(tài)進(jìn)入土壤和水環(huán)境，誘發(fā)和傳播各種抗生素抗性菌，導(dǎo)致土著菌株攜帶多種抗性基因而發(fā)生變性，造成水環(huán)境、土壤污染，危害生態(tài)系統(tǒng)中的生物存活[1]?；前奉?lèi)藥物價(jià)廉、廣譜，廣泛用于預(yù)防和治療各種疾病，使得細(xì)菌的敏感性減弱，導(dǎo)致抗生素抗性菌株和抗性基因殘留污染環(huán)境，威脅人類(lèi)健康，已在水環(huán)境、土壤中檢測(cè)出sul1、sul2、sul3、int1和int2[2-3]。四環(huán)素類(lèi)藥物是應(yīng)用最早的一類(lèi)化學(xué)治療藥物，并且在許多國(guó)家廣泛使用。雖然城市污水處理廠(chǎng)采取了多種方法和措施去除抗生素，仍然檢測(cè)出較高濃度的四環(huán)素類(lèi)抗生素[4]。席勁瑛等[5]在污水處理廠(chǎng)分離出的21株四環(huán)素抗性菌均屬于腸桿菌科，大多屬于條件致病菌，且有18 株攜帶質(zhì)粒，表現(xiàn)出對(duì)其他5種抗生素具有抗性。

不同環(huán)境介質(zhì)中抗性菌或抗性基因(ARGs)不僅在菌群間遷移、轉(zhuǎn)化，而且在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)傳播，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境，其危害超過(guò)抗生素殘留本身[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，許多學(xué)者開(kāi)展ARGs生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究[7]。劉莉莉[8]等在污水處理廠(chǎng)檢測(cè)到多種具有抗生素抗性的抗性菌。因此，開(kāi)展抗生素殘留、抗生素抗性菌和ARGs 檢測(cè)，對(duì)于污水處理技術(shù)的提高、人類(lèi)生命安全的都顯得十分重要。

基于大觀(guān)霉素(STP)中抗生素、抗性菌及ARGs 殘留較高的原因，現(xiàn)以北方城市STP 為研究對(duì)象，檢測(cè)了STP 中磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗生素的含量；分離、鑒定磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗性菌株，檢測(cè)9 種常用抗生素的耐藥性，四種四環(huán)素類(lèi)ARGs和四種磺胺類(lèi)ARGs的污染水平，進(jìn)一步揭示雙重抗生素抗性菌污染的潛在危害，以期為高效抗生素處理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

四環(huán)素、金霉素、土霉素、青霉素、氨芐青霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿奇霉素和利福平抗生素(中國(guó)藥品監(jiān)督管理局)。DNA 提取試劑盒(TIANGEN Company，美國(guó))； DNA回收試劑盒，感受態(tài)細(xì)胞(Escherichiacoli DH5α)，質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工)。

1.2 樣品采集

2017年7—12月期間，從北方某城市采用A2/O工藝污水處理廠(chǎng)間隔3周采集污泥，共計(jì)8次，每次取3個(gè)平行樣。所有取樣器具均經(jīng)滅菌處理后采集2 kg污泥，加入抑菌劑后冷藏保存，在采樣后4 h內(nèi)完成抗性菌分離工作。

1.3 抗生素含量檢測(cè)

應(yīng)用萃取儀進(jìn)行水樣中抗生素的提取、凈化后做HPLC-MS檢測(cè)。具體操作詳見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

1.4 抗生素抗性菌的分離與耐藥性檢測(cè)

制備兩種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，一種未加任何抗生素，另一種添加16 mg/mL的四環(huán)素。添加四環(huán)素的培養(yǎng)液稀釋10倍后取100 μL，另取未添加抗生素的培養(yǎng)液100 μL，分別涂布在抗生素抗性平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d后，挑取單個(gè)菌落，在含有四環(huán)素類(lèi)抗生素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上劃線(xiàn)分離培養(yǎng)，重復(fù)3次。

應(yīng)用上述方法，制備兩種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，進(jìn)行磺胺類(lèi)抗性菌和雙重抗性菌的分離[10]。

將分離的抗性菌培養(yǎng)后，按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的規(guī)則，通過(guò)微量肉湯稀釋法測(cè)定抗生素最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，進(jìn)行四環(huán)素抗性菌株的抗生素敏感性檢測(cè)，確定藥物敏感性的臨界點(diǎn)[11]。所有檢測(cè)均設(shè)3 次平行重復(fù)。

1.5 抗生素抗性菌的耐藥性檢測(cè)

采用微量液體稀釋法進(jìn)行四環(huán)素抗生素耐藥性檢測(cè)[12]。 在含有四環(huán)素營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，將所分離培養(yǎng)的菌株接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，所獲得的新鮮菌液分別接種于含濃度梯度為2～210mg/L的氨芐青霉素、青霉素、氯霉素、頭孢氨芐、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、慶大霉素和利福平的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，在37 ℃生物培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～24 h后測(cè)定光密度(optical density, OD)。

應(yīng)用上述方法進(jìn)行磺胺類(lèi)抗性菌和雙重抗性菌的耐藥性的檢測(cè)[13]。

1.6 抗性菌的抗性基因檢測(cè)

選取四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因tetW、tetQ、tetM和tetX作為目的基因，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[14]，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)方法檢測(cè)四環(huán)素抗性基因。按照DNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法提取DNA后檢測(cè)含量及純度。

應(yīng)用上述方法進(jìn)行磺胺類(lèi)抗性菌和雙重抗性菌抗性基因的檢測(cè)。

選取雙重抗性菌分別進(jìn)行磺胺類(lèi)抗生素抗性基因sul1、sul2、int1、int2和四環(huán)素tetA、tetQ、tetM、tetX基因的檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS15.0 軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05 為有顯著意義，P<0.01 為有極顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素檢測(cè)

本研究中，對(duì)城市污水處理廠(chǎng)采集的污泥進(jìn)行四環(huán)素、磺胺甲惡唑的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)性較小，有較好的一致性。污水中四環(huán)素的殘留量略高于磺胺甲惡唑；冬季的抗生素殘留量高于夏季。四環(huán)素的殘留量最高為203～371 mg/mL,最低為57～101 mg/mL；磺胺甲惡唑的殘留量為 38～74 mg/mL。四環(huán)素是應(yīng)用廣泛的抗生素，推測(cè)為此種抗生素使用劑量較少的原因所致[15]。結(jié)果如圖1所示。

圖1 四環(huán)素和磺胺甲惡唑抗生素濃度檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of tetracycline and sulfamethoxazole antibiotic concentration

2.2 抗性菌的分離結(jié)果

由表1可見(jiàn)，檢測(cè)污泥的總細(xì)菌數(shù)為1.57×108～2.36×108CFU/mL，四環(huán)素抗性細(xì)菌數(shù)為2.78×106～7.45×106CFU/mL，抗性菌所占比例為1.5%～3.6%；磺胺甲惡唑抗性細(xì)菌數(shù)為2.59×106～5.91×106CFU/mL，抗性菌所占比例為1.4%～2.8%；雙重抗性細(xì)菌數(shù)為5.04×105～2.51×106CFU/mL，抗性菌所占比例為0.3%～1.1%；推測(cè)污泥中菌群受四環(huán)素類(lèi)抗生素影響較大[16]。

2.3 抗性菌的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

本研究中，四環(huán)素抗性菌株對(duì)利福平的耐受性最弱，呈現(xiàn)雙極性，對(duì)氯霉素具有最強(qiáng)的耐受性。同樣，磺胺類(lèi)抗性菌株對(duì)抗生素的抗性作用相同。多重抗性菌株也對(duì)氯霉素具有最強(qiáng)的耐受性，對(duì)利福平的耐受性最弱，結(jié)果見(jiàn)圖2?？剐跃昃哂卸嘀乜股乜剐?，可能殘留的多種抗生素未完全被代謝和分解，在持續(xù)性抗生素驅(qū)動(dòng)下可誘發(fā)抗性基因突變，在微生物體內(nèi)中傳播抗性所致[17]。國(guó)外學(xué)者分離125 株攜帶大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗性基因ermB的葡萄球菌中有117 株攜帶四環(huán)素抗性基因tetM[18]，表明抗性菌株含有多重抗性。

圖2 抗性菌株對(duì)9 種抗生素的最小抑制濃度分布Fig.2 Minimum inhibitory concentration distribution of resistant strains with nine kind of antibiotics

表1 四環(huán)素和磺胺類(lèi)抗性菌數(shù)量及所占總活菌數(shù)目的比例Table 1 Number of tetracyclines and sulfonamides resistant bacteria and their proportion in total viable bacteria

2.4 抗性菌的抗性基因檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetA、tetM、tetQ、tetX和磺胺類(lèi)抗性基因sul1、sul2、int1、int2，結(jié)果如圖3所示。四環(huán)素抗性外排泵抗性基因tetQ 和tetA 具有最高豐度，并且酶修飾抗性基因tetX和tetM較低。在四種抗性基因中，tetA屬于外部泵蛋白的機(jī)制，tetM屬于核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制，tetX屬于滅活或滅活四環(huán)素酶的機(jī)制。tetQ編碼具有最高豐度的核糖體保護(hù)性蛋白質(zhì)基因，這表明四環(huán)素抗性基因殘基與抗性機(jī)制無(wú)關(guān)。張衍等[19]研究認(rèn)為四環(huán)素類(lèi)不同抗性基因之間的豐度差別很大，tetM的比例含量最低，而tetQ為優(yōu)勢(shì)基因，豐度、表達(dá)均值最高。 在采集的所有樣品中，兩種編碼核糖體保護(hù)蛋白基因tetM較低，表明抗性基因存在較大的傳播風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)檢測(cè)目的基因的絕對(duì)拷貝數(shù)相對(duì)于基因16S rRNA的絕對(duì)拷貝數(shù)的含量，表達(dá)微生物群落中抗性基因的含量。冬季和夏季樣本中抗性基因水平增加，表明抗性基因不僅受抗生素濃度的影響，還與陽(yáng)光、溫度、pH、紫外線(xiàn)與重金屬等因素有關(guān)，其相關(guān)性需要后期大量的研究進(jìn)行證明[20]。

3 結(jié)論

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究，得到以下結(jié)論。

(1)四環(huán)素和磺胺嘧啶量多、使用時(shí)間久，殘留較高。

(2)污水處理廠(chǎng)污泥中攜帶磺胺類(lèi)抗性基因的四環(huán)素抗生菌株數(shù)量高于攜帶四環(huán)素抗性基因的磺胺嘧啶抗性菌株。

(3)四環(huán)素抗性基因tetX、磺胺類(lèi)抗性基因sul1檢出率較高。