鄧清華，宋景旭，劉婷，張焱，謝志鳳，劉國文,2*

（1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院，內(nèi)蒙古通遼028000；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，長春130062；3.吉林省松原市前郭縣醫(yī)院，吉林松原138000）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中一種特殊的結構，其形狀和結構決定了該細胞器內(nèi)發(fā)生的生物功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由一個復雜的膜系統(tǒng)組成，分泌蛋白和膜蛋白的合成、折疊和翻譯后修飾，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結構是動態(tài)的，通過快速變化以滿足細胞對生理或病理刺激的需求[1]。不同來源和不同功能的細胞也表現(xiàn)出不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構[2]。然而，當細胞受到低氧、營養(yǎng)缺失、鈣離子紊亂、氧化應激以及病毒感染等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能被破壞，導致錯誤蛋白或未折疊的蛋白質(zhì)大量蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)難以承受高負荷的蛋白折疊時則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）[3]。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以引起脂代謝紊亂，增加脂合成，引發(fā)脂肪肝[4]。人類非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是與肥胖密切相關的疾病。有很多研究指出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與NAFLD的發(fā)病有關[5-7]。圍產(chǎn)期奶牛脂質(zhì)代謝紊亂，常常發(fā)生肝脂沉積、酮病、胰島素抵抗等營養(yǎng)代謝性疾病，這些代謝病都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激密不可分。

含黃素單加氧酶（Flavin Containing Monooxy?genase，F(xiàn)MO）3是FMOs的一種亞型，主要在肝臟中表達，其廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[8]。FMO3是近五年發(fā)現(xiàn)的與脂代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等相關的調(diào)節(jié)因子[9]。由于奶牛特殊的代謝特征，它的代謝過程可能與人和鼠的不同，所以本實驗以奶牛肝細胞為研究對象，通過添加NEFA誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，研究FMO3在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡健康荷斯坦犢牛。

1.2 主要試劑

天根2×Taq PCR Mastermix；碧云天細胞裂解液（PMSF）；Takara DL2000 DNA Marker和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；Roche熒光定量試劑；FMO3和β-actin一抗均購于CST，羊抗兔二抗購于BOSTER；NEFA（配制方法：油酸4.35 mmol·L-1，亞油酸0.49 mmol·L-1，棕櫚酸3.19 mmol·L-1，硬脂酸1.44 mmol·L-1，棕櫚油酸0.53 mmol·L-1。113 mL 0.1 mol·L-1 KOH加熱至60℃，以上5種酸充分溶解后加入7.5 mL預熱至60℃的1 mol·L-1的HCl，充分混勻后加入67.8 mL預熱至60℃的五餾水，即配制成53.4 mmol·L-1的貯存液，放于-20℃冷藏備用）。

1.3 試驗方法

1.3.1肝細胞的分離與培養(yǎng)

1日齡的禁食犢牛以無菌方法取出肝臟尾狀突。用兩步灌流法分離犢牛原代肝細胞[10]。分離后用貼壁培養(yǎng)基稀釋至5×105個細胞·mL-1，每孔2 mL接種至6孔細胞培養(yǎng)板，在37℃，5%CO2下進行培養(yǎng)4 h后換基礎培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)操作。

1.3.2腺病毒載體的構建及感染肝細胞

根據(jù)GenBank中牛FMO3基因的編碼序列，構建FMO3基因的低表達和過表達腺病毒載體，培養(yǎng)HEK293細胞進行病毒的包裝、擴增和純化，所得重組腺病毒測定其滴度，并達到109 PFU·mL-1開始收集病毒。將體外分離的肝細胞貼壁培養(yǎng)72 h后用低表達、過表達和空腺病毒載體感染，每組6個重復孔，病毒感染復數(shù)（MOI）設為100[11]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞保存于-80℃。

1.3.3 NEFA刺激犢牛原代肝細胞

添加NEFA（2.4 mmol·L-1），每組6個重復孔，刺激9 h后感染腺病毒。

1.3.4細胞分組

細胞總共分為7組，設空白對照組（Control）、低表達FMO3腺病毒載體組（LOW）、過表達FMO3組（OVER）、陰性對照組（NC，腺病毒空載體）、NEFA組（添加2.4 mmol·L-1 NEFA）、低表達FMO3腺病毒載體與NEFA混合添加組（NEFA+LOW）、過表達FMO3腺病毒載體與NEFA混合添加組（NE?FA+OVER）。

1.3.5實時熒光定量PCR

細胞感染48 h后用Trizol收集細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank中牛的FMO3、XBP-1s、ATF4、ATF6、P58IPK和β-actin基因序列，用primer5軟件設計引物，引物序列見表1。以β-actin為參照，用Step One Plus熒光定量PCR檢測FMO3、XBP-1s、ATF4、ATF6和P58IPK的mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR相關引物

1.3.6 western-blot

細胞感染48 h后收取各組細胞，用PBS清洗2次，棄掉液體。加入250μL裂解液，冰上裂解15 min，14 000 r·min-1離心15 min，取上清。用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取40μg進行蛋白免疫印跡試驗。

2 結果與分析

2.1 犢牛原代肝細胞感染重組腺病毒

如圖1所示，犢牛原代肝細胞感染FMO3低表達（見圖1A）和過表達（見圖1B）腺病毒載體后，綠色熒光蛋白的表達量可以達到70%左右。說明重組腺病毒可以穩(wěn)定地在犢牛原代肝細胞中表達。

2.2 FMO3低表達和過表達腺病毒載體對犢牛原代肝細胞FMO3 mRNA和蛋白水平的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，F(xiàn)MO3低表達腺病毒明顯降低了FMO3的mRNA和蛋白表達水平（P<0.01），而FMO3過表達腺病毒明顯增加了FMO3的mRNA和蛋白表達水平（P<0.01），陰性對照組（NC）與空白對照組相比沒有顯著差異（P>0.05）（見圖2）。

2.3 FMO3和NEFA對犢牛原代肝細胞XBP-1s、ATF4、ATF6和P58IPK mRNA水平的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，NEFA能明顯增加奶牛肝細胞中XBP-1s的mRNA表達水平（P<0.01）；NC組與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05）；NEFA+OVER組明顯高于空白對照組和NEFA組（P<0.01）；NEFA+LOW組明顯低于空白對照組和NEFA組（P<0.01）（見圖3A）。

圖1細胞感染FMO3腺病毒后熒光共聚焦結果（100×）

與空白對照組相比，NEFA能明顯增加奶牛肝細胞中ATF4的mRNA表達水平（P<0.01）；NC組與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05）；NEFA+OVER組明顯高于空白對照組和NEFA組（P<0.01）；NEFA+LOW組明顯低于NEFA組（P<0.01）但是與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）（見圖3B）。

與空白對照組相比，NEFA能明顯增加奶牛肝細胞中ATF6的mRNA表達水平（P<0.01）；NC組與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05）；NEFA+OVER組明顯高于空白對照組和NEFA組（P<0.01）；NEFA+LOW組明顯低于NEFA組（P<0.01）但是與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）（見圖3C）。

圖2 FMO3低表達和過表達對FMO3 mRNA和蛋白表達量的影響

圖3犢牛原代肝細胞感染低表達、過表達和空載體48 h后用qRT-PCR檢測XBP-1s，ATF4，ATF6和P58IPK的mRNA表達量

與空白對照組相比，NEFA能明顯增加奶牛肝細胞中P58IPK的mRNA表達水平（P<0.01）；NC組與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05）；NEFA+OVER組明顯高于空白對照組和NEFA組（P<0.01）；NEFA+LOW組明顯低于NEFA組（P<0.01）但是與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）（見圖3D）。

3 討論

ER廣泛存在于真核細胞中，是細胞中最大的細胞器。ER在細胞中具有重要的作用，不僅是蛋白質(zhì)合成、折疊、加工及其質(zhì)量監(jiān)控的重要場所，還是鈣離子儲存的主要場所，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還是脂質(zhì)代謝發(fā)生的主要場所[12]。為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡，在肌醇需求酶1（Inositol-requiring Enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（Protein kinase R-like Endoplasmic Reticulum Kinase，PERK）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（Activating Transcription Factor 6，ATF6）三種相對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的作用下，觸發(fā)了未折疊蛋白反應（Unfolded Protein Response，UPR），激活了三種途徑[13]。作為對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的響應，PERK的激活通過真核細胞翻譯起始因子2α（Eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化來調(diào)節(jié)細胞蛋白質(zhì)的合成，轉(zhuǎn)錄因子ATF4優(yōu)先被翻譯[14]。IRE-1通過從X盒結合蛋白（X box-binding protein，XBP-1）mRNA剪接26個核苷酸觸發(fā)下游信號的變化，剪接的XBP1 mRNA編碼一種功能性轉(zhuǎn)錄因子，介導折疊機械和脂質(zhì)合成基因的誘導，這兩種基因都是正確的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應所必需的[15]。ERS狀態(tài)下，ATF6被切割并進入細胞核，促進ERS基因的轉(zhuǎn)錄。這些信號級聯(lián)的激活導致各種UPR靶基因的上調(diào)，以恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[16]。在小鼠中，PERK、IRE1和ATF6的基因敲除揭示了這三個傳感器不僅對病理性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而且對生理性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的特異性作用[17]。分子伴侶蛋白P58IPK是PERK的負調(diào)節(jié)因子，定位在ER管腔中[18]。缺少P58IPK的小鼠比野生型產(chǎn)仔弱，并且由于胰腺b細胞功能受損而患上糖尿病[19]。對缺乏P58IPK或ATF6的動物研究表明，P58IPK的主要功能是保護ER的蛋白質(zhì)折疊能力，并增加了P58IPK可能在內(nèi)分泌胰腺以外的組織中發(fā)揮這一作用的可能性[20]。

FMO3主要分布于肝臟組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MO3過度表達腺病毒與NEFA混合添加能增加奶牛肝細胞中XBP-1、ATF4、ATF6和p58IPK的mRNA表達量，然而FMO3低表達腺病毒與NEFA混合添加卻能降低奶牛肝細胞中XBP-1、ATF4、ATF6和p58IPK的mRNA表達量。NEFA明顯增加了XBP-1、ATF4、ATF6和p58IPK的mRNA表達量。這些結果說明，NEFA可以誘導奶牛肝細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，并且FMO3過表達腺病毒能增加NEFA誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，而FMO3低表達能降低NEFA介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與脂代謝的關系密不可分，可通過調(diào)節(jié)ERS來調(diào)節(jié)肝臟脂代謝反應，降低FMO3的表達量降低奶牛圍產(chǎn)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，從而降低脂代謝。以上研究結果可為奶牛內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生機理提供一定的理論基礎，并為奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝病的防治提供堅實的理論依據(jù)。