李曉蓉，蔡 偉，張 淼，周小平，4，黃 錚，徐美蓉，李 婷，王 波，4

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所（農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所），甘肅蘭州 730020；2.甘肅省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730010；3.禮縣春天藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅隴南 742200；4.蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010）

超臨界流體（SCF） 作為流動相已有50 年的歷史[1-2]。相對于傳統(tǒng)的RP-LC，SCF 具有較低的黏度、較高的擴散系數(shù)，以及在較高的流速下具有較小的壓力降，而且SCF 同樣適用于熱不穩(wěn)定的化合物[3-5]。超高效合相色譜（UPC2） 是傳統(tǒng)HPLC 和SFC 技術(shù)的結(jié)合，相對于傳統(tǒng)SFC 重復(fù)性差的缺點，UPC2能夠精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)的壓力、溫度及流速的穩(wěn)定性，從而獲得較好的重現(xiàn)性。此外，UPC2在分離過程中不僅具有很高的柱效，且分析速度快、靈敏度高、有機溶劑使用量少[6-8]。

大黃為常見的臨床中藥之一，源自蓼科植物大黃屬干燥根、根莖，以大黃素等蒽醌類化合物為主要有效成分，發(fā)揮導(dǎo)瀉、解毒、化瘀、活血等作用[9]。大黃中蒽醌類化合物的主流分離方法包括液相色譜法[10-12]和串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]，然而這些方法具有較長的分離時間（＞30 min），目標(biāo)物分離也僅限于簡單的方法學(xué)考查，并未通過研究目標(biāo)物的保留行為對后續(xù)的同類研究起到指導(dǎo)作用；或僅對目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對照品） 進(jìn)行保留行為的研究，而未應(yīng)用到實際樣品檢測中。

鑒于上述問題，首次基于UPC2 技術(shù)對不同分離參數(shù)（助溶劑、pH 值、洗脫梯度、動態(tài)背壓和溫度等） 下蒽醌類化合物的分離度、拖尾因子和保留時間的變化規(guī)律研究其保留行為，并應(yīng)用到實際大黃樣品的檢測，最終為UPC2技術(shù)應(yīng)用到天然產(chǎn)物分離分析提供技術(shù)支撐，同時為中藥的超快速分離提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPC2型超高效合相色譜儀，美國Waters 公司產(chǎn)品；配有二元溶劑輸送泵、自動進(jìn)樣裝置、柱溫箱和背壓調(diào)節(jié)器；3K30 型冷凍離心機，美國SIGMA 產(chǎn)品；MS3 型渦旋儀，德國IKA 產(chǎn)品；100～1 000 μL以及1.0～5.0 mL 移液槍，美國Thermo 產(chǎn)品。

大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酚，Dr.Ehrenstorfer 公司提供， （純度≥98.5%）；CO2（純度≥99.997%）；甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷，均為色譜純。其余試劑均為分析純。

6 份大黃樣品，在陰涼通風(fēng)處保存，待用。

蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)信息見表1。

表1 蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)信息

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將藥材粉碎后過60 目篩，精密稱取1.00 g 放入50 mL 聚乙烯管中，加入30 mL 甲醇，稱質(zhì)量，超聲處理20 min 后取出放置至室溫，甲醇補失質(zhì)量，提取液用0.22 μm 有機相膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

定量移取質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，甲醇稀釋定容，最終配制成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，20.0，50.0，100.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于4 ℃下冷藏待用。

1.2.3 UPC2分離條件

AcquityUPC2HSSSBC18色譜柱（100 mm×1.7 mm，3.0 μm）；流速2.0 mL/min；流動相A 為CO2，B 為甲醇；梯度洗脫；背壓為11.03 MPa；進(jìn)樣量為1.0 μL；色譜柱和樣品盤溫度分別為40 ℃和20 ℃，檢測波長為260 nm。

梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 蒽醌類化合物的保留行為

2.1.1 助溶劑對保留行為的影響

助溶劑的作用首先通過增加流動相的溶劑化（溶解） 能力，其次是與溶質(zhì)和/或固定相起特定的作用，從而改變和/或提高溶劑的選擇性；而影響溶解度與選擇性的決定因素就是助溶劑與溶質(zhì)分子間的范德華力或助溶劑與溶質(zhì)間特定的分子作用力等[3]。分別考查了甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈等4 種常用的有機助溶劑對5 種蒽醌類化合物在Acquity UPC2HSS SB C18色譜柱的保留及選擇性的影響。

不同助溶劑對蒽醌類化合物的影響見圖1。

由圖1 可知，使用乙腈作為有機助溶劑時，由于乙腈缺少H+供給能力，從而減弱了固定相與大黃酸（3） 之間的分配能力，不僅使大黃酸的保留能力增強（6.0 min 內(nèi)未出峰），而且改變了色譜柱的選擇性。助溶劑為異乙醇、乙醇或甲醇時，可以明顯觀察到5 種蒽醌類化合物的出峰順序未發(fā)生改變，當(dāng)助溶劑為甲醇時，大黃酸（3） 與大黃素（4） 的分離度（R） 達(dá)到1.6，符合分離的要求。這說明了醇類作為H+供體助溶劑，能夠與目標(biāo)物形成分子間作用力，通過這些作用力而改變色譜保留行為及色譜峰形；隨著SCF-CO2的溶解能力逐漸增強，目標(biāo)物的峰形，即拖尾因子（Tailing factor，Tf）、保留時間（Retention time，tR） 和分離度（Resolution，Rs） 也會受到相應(yīng)的影響。經(jīng)計算得出，隨著醇類助溶劑極性的增加，蒽醌類化合物的保留時間依次減少0.07，0.19，0.21，0.36，0.58 min，這說明助溶劑對流動相的影響主要體現(xiàn)在自身極性的高低上，醇類助溶劑的極性越大，流動相溶劑化能力越強，洗脫能力也就越強。其次，醇類助溶劑對蒽醌類化合物的拖尾因子影響不大，其拖尾因子范圍在0.91～1.76；再者，通過分離度的比較可知，除乙醇和異丙醇作為助溶劑時大黃素（4） 與大黃酸（3） 的分離度＜1.50 外，其余均符合分離要求。由此可見，甲醇在蒽醌類化合物分離過程中是較優(yōu)的助溶劑。

2.1.2 柱溫對保留行為的影響

溫度對SCF 的影響機理比較復(fù)雜，主要體現(xiàn)在溫度的變化對SCF 的密度、黏度、溶解度和洗脫能力的相互影響，這些因素的影響常使很多有機化合物在UPC2的分析中體現(xiàn)復(fù)雜的交叉行為。分別考查了柱溫在30～60 ℃下蒽醌類化合物的保留及選擇性。

不同溫度對蒽醌類化合物的影響見圖2。

由圖2 可知，溫度為30 ℃時，蒽醌類化合物達(dá)到了基線分離，且峰形較好；當(dāng)色譜柱溫度為40 ℃時，大黃酸（3） 和大黃素（4） 開始有部分的重合；色譜柱溫度為50 ℃時，大黃酸（3） 和大黃素（4）幾乎完全的重合；當(dāng)溫度為60 ℃時，大黃酸（3） 和大黃素（4） 完全重合；此外，與傳統(tǒng)的RP-LC 相反，隨著溫度的升高，蒽醌類化合物的保留時間增加。同樣，經(jīng)計算不同溫度對目標(biāo)物tR，Tf，Rs 的變化可以看出，溫度從30 ℃升高至60 ℃的過程中，蒽醌類化合物的保留時間分別增長了46%，47%，23%，17%，17%，由此可以推斷，溫度對蒽醌類化合物的影響與其出峰順序相關(guān)，即出峰時間越早的化合物，受到溫度的影響越大；而對于Tf 和Rs，蒽醌類化合物受溫度的影響并無規(guī)律可循，這是由于溫度的變化不僅影響流動相的黏度和溶解能力，而且在試驗優(yōu)化過程中，助溶劑的加入和梯度洗脫使得系統(tǒng)很難處在完全超臨界狀態(tài)，所以它們之間的動力學(xué)及熱力學(xué)更為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

2.1.3 背壓對保留行為的影響

就壓力而言，SCF 的密度隨著系統(tǒng)背壓的增加而增加，其溶解度增強，目標(biāo)物的保留時間會減小。一般情況下，在試驗優(yōu)化過程中，為了降低樣品分析時間，改善峰形和/或提高重現(xiàn)性，可以在系統(tǒng)壓力允許的情況下，適當(dāng)增加系統(tǒng)背壓來優(yōu)化。分別考查了系統(tǒng)背壓在11.03～15.16 MPa 下蒽醌類化合物的保留及選擇性。

不同背壓對蒽醌類化合物的影響見圖3。

由圖3 可知，當(dāng)系統(tǒng)背壓為11.03～15.16 MPa時，蒽醌類化合物均達(dá)到基線分離；當(dāng)系統(tǒng)背壓為11.03 MPa 時，基線漂移，且信號噪音較大，當(dāng)背壓在13.78 MPa 以上時，基線平穩(wěn)，信號噪音較?。贿@是由于背壓較低時，SCF、助溶劑及目標(biāo)物之間的相互溶解能力未能達(dá)到最佳，當(dāng)背壓升高時，基線和信號噪音均得到改善。為更好地了解背壓對蒽醌類化合物保留行為的影響，計算目標(biāo)物的tR，Tf 和Rs等色譜參數(shù)可知，5 種蒽醌類化合物中，tR 的變化率分別為大黃酚19.0%，大黃素甲醚18.8%，大黃酸8.8%，大黃素8.7%，蘆薈大黃素7.7%，上述數(shù)據(jù)可以推斷出，化合物的保留越強，其保留時間對壓力的變化越敏感；而Tf 均在0.92～2.01，對化合物的色譜峰形影響不大。由上可知，系統(tǒng)背壓對于蒽醌類化合物的分離過程中并不屬于重要的參數(shù)。

2.1.4 洗脫梯度對保留行為的影響

使用UPC2對蒽醌類化合物進(jìn)行分離時，相對于簡單的對照品分離，一般僅需采用等度洗脫即可完成，而對于復(fù)雜的樣品和/或結(jié)構(gòu)相似的化合物，選擇梯度洗脫既能縮短分析時間，又可提高靈敏度。與傳統(tǒng)LC 相似，洗脫梯度的改變直接影響結(jié)構(gòu)相似的同一類分析物的保留行為。試驗在80%系統(tǒng)最高壓力的范圍內(nèi)，通過改變助溶劑的初始比例（A∶B=99∶1～94∶6，V/V） 來考查蒽醌類化合物的的分離效果。

不同洗脫梯度對蒽醌類化合物的影響見圖4。

由圖4 可知，助溶劑B 初始比例的改變對蒽醌類化合物的影響主要體現(xiàn)在tR 上。隨著助溶劑初始比例的增加，流動相的溶解能力、密度和超臨界狀態(tài)均隨之改變，為了更好地反映助溶劑等比例改變對蒽醌類化合物的影響程度，以5 種蒽醌類化合物在不同初始比例下的保留時間為縱坐標(biāo)，助溶劑初始比例為橫坐標(biāo)，制作雷達(dá)圖。

洗脫梯度對蒽醌類化合物保留時間的影響見圖5。

由圖5 可知，蒽醌類化合物在助溶劑（B） 的初始比例為1%～5%時，保留時間幾乎等比例減小，當(dāng)助溶劑（B） 初始比例大于5%時，蒽醌類化合物的保留時間有著較大的改變；這種現(xiàn)象主要是因為隨著有機相初始比例的增加，當(dāng)助溶劑的比例小于5%時，流動相仍然保持著SCF 狀態(tài)，且較小比例助溶劑的加入，流動相的溶解和/ 或洗脫能力仍以SCF為主；當(dāng)助溶劑比例大于5%時，較高比例助溶劑的加入使得流動相的狀態(tài)由超臨界流體逐漸成為亞臨界流體，其分離機理表現(xiàn)為更復(fù)雜的混合洗脫模式；有文獻(xiàn)指出，當(dāng)助溶劑比例達(dá)35%以上時，流動相的洗脫能力以有機相溶劑為主，表現(xiàn)出較為典型的正相或反相洗脫模式，而超臨界流體所發(fā)揮的洗脫和/保留能力大幅度減弱[1]；故在UPC2的方法優(yōu)化中，可通過增加與目標(biāo)物相對應(yīng)的階段性洗脫梯度的有機相比例來實現(xiàn)分離優(yōu)化。

2.2 方法學(xué)考查

2.2.1 專屬性

對樣品進(jìn)行處理后，分別量取5 種蒽醌類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液和樣品溶液適量，經(jīng)色譜進(jìn)樣分析，樣品中雜質(zhì)成分與5 種蒽醌類化合物的色譜峰均分離良好，該方法具有良好的專屬性。

2.2.2 精密度

精密量取高、中、低3 種質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液，最優(yōu)色譜條件下測定蒽醌類化合物的日內(nèi)和日間精密度。通過計算5 種蒽醌類化合物的含量，得到5 種蒽醌類化合物含量的日內(nèi)精密度（RSD） 范圍為1.8%～3.5%，日間精密度（RSD） 分別為0.9%～1.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 方法重復(fù)性

取同一批大黃樣品，將其平均分為6 份，對樣品進(jìn)行處理，色譜分析，計算RSD 值。5 種蒽醌類化合物在大黃樣品中均有檢出，平均含量分別為大黃酚456.38 mg/kg，大黃素甲醚112.01 mg/kg，大黃酸771.38 mg/kg，大黃素226.90 mg/kg，蘆薈大黃素125.88 mg/kg，RSD 范圍為3.39%～10.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 樣品穩(wěn)定性

取同一批大黃樣品，平均分為3 份，對樣品進(jìn)行處理，處理后的溶液密封后，于室溫下自然放置，分別于0，2，4，8，12，24 h 后取出該溶液1.0 mL，按1.2.3 中色譜條件對樣品進(jìn)行分析，以5 種蒽醌類化合物的含量為指標(biāo)，最終其含量的RSD 范圍為3.93%～7.34%，表明樣品提取液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 線性范圍及檢出限

對混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，每個質(zhì)量濃度點進(jìn)樣3 次，以平均峰面積值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（mg/L） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以S/N=3 和S/N=10 分別確定其檢出限和定量限。

蒽醌類化合物的線性范圍、檢出限及定量限見表3。

由表3 可知，5 種蒽醌類化合物的檢出限及定量限除大黃酸分別為0.50，1.00 mg/kg，線性范圍在1.00～100.00 mg/kg 外；其余蒽醌類化合物分別為0.25 mg/kg 和0.50 mg/kg，線性范圍RSD 范圍在0.50%～100%，能夠滿足實際樣品檢測的要求。

2.2.6 加標(biāo)回收率

取已知含量的同一批大黃樣品6 份，分別加入高、中、低3 種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)前處理及色譜分析后，計算5 種蒽醌類化合物的加標(biāo)回收率。目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率范圍為89.94%～112.84%，RSD 為1.3%～8.4%，表明所建立的方法具有較好的準(zhǔn)確度，可以滿足后續(xù)試驗要求。

2.3 樣品的測定

取所收集的大黃樣品，準(zhǔn)確稱取1.00 g，按1.2.1方法進(jìn)行樣品處理，按1.2.3 中所述的色譜條件進(jìn)樣分析，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次，計算大黃中5 種蒽醌類化合物的含量。

樣品中5 種蒽醌類化合物的含量見表4；大黃樣品UPC2色譜圖見圖6。

由圖6 可知，因其保留行為與傳統(tǒng)LC 不同，樣品分離過程中5 種蒽醌類化合物峰形對稱，與樣品中的雜質(zhì)分離良好，并在1.6 min 內(nèi)即完成了分離，分離速度是傳統(tǒng)LC 的5～10 倍。此外，由表9可知，6 種大黃樣品中5 種蒽醌類化合物的含量分別為大黃酚235.42～586.37 mg/kg，大黃素甲醚99.58～158.21 mg/kg，大 黃 酸902.67～539.14 mg/kg，大黃素102.98～236.29 mg/kg，蘆薈大黃素87.26～157.49 mg/kg。其測定結(jié)果與文獻(xiàn)[15]結(jié)果一致，由此可以看出，UPC2在中藥和/或天然產(chǎn)物分離中不僅分析速度快、環(huán)境友好，且能夠作為傳統(tǒng)LC 分析范圍的補充，甚至延伸，為中藥和/或天然產(chǎn)物分析提供新思路。

表4 樣品中5 種蒽醌類化合物的含量 / mg·kg-1

3 結(jié)論

首次采用UPC2同時測定了大黃中的5 種蒽醌類化合物成分。通過蒽醌類化合物的保留行為可以得出，對于蒽醌類化合物，初始梯度的改變并不能顯著改善選擇性及色譜峰形；通過改變背壓或者色譜柱溫度有利于調(diào)節(jié)分析時間，但溫度和背壓相互影響、相互制約；甲醇相對于其他有機溶劑具有較強的洗脫能力，且對于蒽醌類化合物而言具有較好的選擇性及色譜峰形。通過方法學(xué)考查，表明該方法靈敏度高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，檢測時間短，完成一次實際樣品分析僅4.0 min，與文獻(xiàn)相比，分析速度比傳統(tǒng)LC 快近5～10 倍，可用于大黃中蒽醌類成分含量的快速測定，為大黃質(zhì)量控制提供參考和技術(shù)支持，并可以與傳統(tǒng)LC 在中藥和/或天然產(chǎn)物檢測方法上進(jìn)行互補。