馬 強，石雅君，李正男，王文輝，孫平平

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院，呼和浩特010018）（2中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所）

我國是世界上最大的梨生產(chǎn)國[1]，由擴展青霉Penicillium expansum引起的梨青霉病是發(fā)生最普遍、危害最嚴重的梨采后真菌病害，給果農(nóng)和經(jīng)銷商造成了嚴重的經(jīng)濟損失。該病害在梨果運輸、貯藏過程中均可發(fā)生，病原菌可經(jīng)傷口侵入，病果與健康果實也可通過接觸傳播，感病梨果肉由外向內(nèi)腐爛，果肉凹陷，在果實表面先產(chǎn)生白色菌絲，隨后產(chǎn)生青綠色、堆粉狀病菌孢子霉斑，且伴有強烈的發(fā)霉氣味[2]。另外，P.expansum產(chǎn)生的展青霉素具有致畸、致癌和免疫毒性，危害人體健康[3]。目前，針對青霉菌主要利用多菌靈、甲基硫菌靈、苯來特、噻苯咪唑等化學藥劑進行防治，但長期使用化學殺菌劑會對人類健康和環(huán)境造成危害，且易導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而降低防效[4]，因此對青霉病的綠色防控成為替代化學防控的主要措施。

利用拮抗微生物防治果蔬采后病害是近年來的研究熱點[5]，其中酵母菌作為安全、無毒、不污染環(huán)境、抗病強、繁殖快的有益微生物受到廣泛的關注。目前，在果蔬采后病害控制中效果較好的酵母菌主要有假絲酵母屬Candida、隱球酵母屬Cryptococcus、梅奇酵母屬Metschnikowia、畢赤酵母屬Pichia、紅酵母屬Rhodotorula和絲孢酵母屬Trichosporon等[5-8]。然而，這些生防菌株遠不能滿足我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，篩選出更多具有較好防治效果的酵母菌仍然是當務之急。內(nèi)蒙古地區(qū)氣候條件多樣、微生物資源豐富[9]，從該地區(qū)篩選出對病害具有抑制活性的酵母菌，將為植物病害的綠色防控提供更多的資源。目前，對從內(nèi)蒙古地區(qū)分離酵母菌的研究主要集中在奶制品、飼料、釀酒以及重金屬降解上[10-13]，利用酵母菌對植物病害進行防治，僅見宋娟[14]篩選出Pichia anomalax6和Rhodotorula glutinisp2用于厚皮甜瓜采后病害防治的研究。由于研究者更容易從某一發(fā)病區(qū)域內(nèi)長勢良好的植物根基、葉表、體內(nèi)分離出具有很好生防效果的生防菌[15]，因此，本研究從內(nèi)蒙古地區(qū)廢棄果園中長勢良好的‘蘋果梨’葉片上分離篩選到1株酵母菌，探究了該菌株對梨青霉病的防控效果，并確定了其分類地位。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇大小一致、無可見機械損傷的‘黃冠’梨果實30個左右，5 ℃貯藏備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、酵母膏蛋白胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術有限公司；Ezup柱式酵母菌基因組DNA提取試劑盒、Sanprep柱式DNA凝膠回收試劑盒（SK8131）購自生工生物工程（上海）有限公司；PCR擴增試劑盒、pMDTM19-T Vector克隆試劑盒，購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

供試梨青霉菌P.expansum由作者在前期研究中分離得到[16]。將斜面保存的病原菌P.expansum轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，用于后續(xù)離體及活體試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1酵母菌分離及形態(tài)學鑒定

2018年5月，在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市廢棄的病害嚴重的‘蘋果梨’園內(nèi)，選取長勢旺盛的‘蘋果梨’樹，采集4片葉片，裝入自封袋中運至實驗室4 ℃保存。參照Janisiewicz等[17]的方法對葉片上的酵母菌進行分離，將葉片用無菌剪刀剪至1 cm×1 cm左右，置于25 mL含有0.05 mol/L、pH值6.8的磷酸緩沖液中，100 r/min搖床振蕩10 min，在超凈工作臺將洗液梯度稀釋10、100倍后，各取100 μL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單個酵母菌落轉(zhuǎn)入YPD平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，用光學顯微鏡（LEICA ICC50W）觀察其細胞形態(tài)及無性繁殖方式，結(jié)合菌落形態(tài)對分離菌株進行初步鑒定。

1.2.2分離酵母菌對梨青霉病的活體抑制活性

在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)、配制酵母菌懸液和青霉菌孢子懸浮液。具體操作如下：用無菌水將YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d的酵母菌液稀釋至濃度為106個/mL，制成酵母菌懸液；用無菌刀片刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的青霉菌孢子，再用無菌水稀釋至孢子濃度為108個/mL。參照Sadeghian等[18]的方法，用‘黃冠’梨測定分離酵母菌對梨青霉病的活體抑制活性，每個處理重復3次，每處理4個果實。將‘黃冠’梨果實于2%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，無菌水沖洗后晾干。用無菌打孔器在‘黃冠’梨果實赤道部位打5 mm（深）×3 mm（寬）的傷口，用移液器向傷口內(nèi)注入100 μL酵母菌懸液，放入鋪有濾紙的保鮮盒中，保鮮膜封口，20 ℃下保濕培養(yǎng)。以致傷后注入100 μL YPD培養(yǎng)液為對照。處理2 d后，在傷口處接種10 μL梨青霉菌孢子懸浮液，繼續(xù)保濕培養(yǎng)，分別在接種病原菌后第5、10、15、20、25 d觀察發(fā)病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑，并計算PGLY-1對梨青霉病的抑制活性。

抑制活性（%）=（1-處理病斑直徑/對照病斑直徑）×100

1.2.3分離酵母菌對梨青霉病的離體抑制活性

利用平板對峙法測定酵母菌對梨青霉菌的離體抑制活性。挑取培養(yǎng)5 d直徑為6 mm的青霉菌菌餅，置于直徑9 cm的PDA平板中央，并在距離青霉菌菌餅3 cm的2個相對方向，分別接種YPD平板上生長3 d的待測酵母菌菌餅，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每個處理重復3次，以不接種酵母菌的平皿為對照。待對照菌落長滿平板時，觀察并記錄抑菌圈直徑。

同時測定PGLY-1無細胞發(fā)酵液對青霉菌的離體抑制活性。將在YPD平板上培養(yǎng)3 d的PGLY-1菌株轉(zhuǎn)入YPD培養(yǎng)液中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d后，發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液。待融化的PDA溫度降至約50 ℃時，將100 mL PDA與10 mL PGLY-1發(fā)酵上清液混勻，倒入直徑9 cm的平板中，于平板中央接種青霉菌菌餅，然后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。以不加酵母菌發(fā)酵液的PDA為對照，觀察并記錄青霉菌的菌落生長情況。

1.2.4ALY-1的分子鑒定

利用Ezup柱式酵母菌基因組DNA提取試劑盒提取ALY-1總DNA，采用通用引物NL1（GCATAT CAATAAGCGGAGGAAAAG）/NL4（GGTCCGTGTT TCAAGACGG）[19]對其26S rDNA D1/D2區(qū)片段進行擴增。PCR反應體系為：10×buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq酶（5 U/μL）0.5 μL、DNA（100 ng/μL）1 μL，滅菌雙蒸水補平至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用Sanprep柱式DNA凝膠回收試劑盒（SK8131）回收純化，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli菌株DH5α 感受態(tài)細胞，涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選單菌落，將PCR擴增鑒定陽性的單克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件中的 T-test比較分析ALY-1對青霉病的活體抑制活性。使用Vector NTI Advance 11軟件將測序結(jié)果進行校正，提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（登錄號：MN483179）；用BLASTn程序?qū)π蛄羞M行同源序列搜索；應用MEGA 6.0軟件，采用ClustalW算法對序列進行比對，用比鄰法（neighbor-joining，NJ），校正值設定為1 000，并以50%為閾值構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性酵母菌的分離及形態(tài)學鑒定

從采集的‘蘋果梨’樹葉片上分離得到1株酵母菌株，編號為PGLY-1。PGLY-1菌落在YPD培養(yǎng)基上呈乳白色，菌落光滑、濕潤、黏稠、容易挑起，顏色均勻一致。在40倍光學顯微鏡下，觀察到PGLY-1細胞呈卵圓形，無性繁殖方式為單邊出芽，具有典型酵母菌的菌落及細胞形態(tài)特征（圖版4）。

2.2 分離酵母菌對梨青霉病的抑制活性

離體結(jié)合活體測定PGLY-1對梨青霉病的抑制活性，結(jié)果顯示，PGLY-1菌株及其無細胞發(fā)酵液在離體條件下均對梨青霉菌無顯著抑制活性，但其菌懸液在活體條件下對梨青霉病的病斑直徑擴展具有顯著的抑制作用?；铙w條件下，經(jīng)PGLY-1菌懸液處理的‘黃冠’梨在接種青霉菌后的病斑直徑均顯著小于對照，在測定的25 d內(nèi)PGLY-1對青霉病的活體抑制活性均在50%以上。接種5 d后PGLY-1處理的梨青霉病斑直徑為1.21 mm，顯著小于對照的 2.79 mm，對梨青霉病的抑制活性為56.63%；接種25 d后，PGLY-1處理的梨青霉病斑直徑為12.54 mm，極顯著小于對照的28.03 mm，對梨青霉病的抑制活性為55.26%（表1，圖1）。

表1 PGLY-1處理‘黃冠’梨青霉病斑直徑及抑制活性

圖1 酵母菌PGLY-1處理25 d后對青霉病的抑制情況

2.3 分離酵母菌的分子生物學鑒定

以菌株PGLY-1的DNA為模板，對其26S rDNA基因片段進行擴增，得到長度為616 bp的目標片段。采用Vector NTI Advance 11（Thermo Fisher Scientific，USA）軟件對測序結(jié)果進行校正，并將校正后的結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（登錄號：MN483179）。利用BLASTn進行同源性序列搜索，選取相似性較高的Vishniacozyma屬的V.carnescens（EU194464、KT933344、AB035054）、V.tephrensis（DQ000318、KX507032 ）、V.heimaeyensis（DQ000317、JQ768868）、V.psychrotolerans（JN193444、JN193445）、V.taibaiensis（KP263768、AY557601）共11個代表菌株序列，并以隱球酵母屬的Cryptococcus diffluens（AF181543、KM085333）為外參序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示，菌株PGLY-1與V.carnescens種的3個菌株聚集在同一支上（圖2），PGLY-1與V.carnescens代表菌株CBS973（AB035054）的26S rDNA基因的序列一致性達到100%，因此確定PGLY-1為Vishniacozyma carnescens。

圖2 基于26S rDNA序列構(gòu)建菌株PGLY-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

本研究從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市廢棄的‘蘋果梨’園內(nèi)長勢好的梨樹葉片上，分離到1株可顯著抑制梨青霉菌擴展的酵母菌V.carnescens，該發(fā)現(xiàn)為內(nèi)蒙古地區(qū)酵母菌資源的利用提供了更多的基礎。V.carnescens原被歸為Cryptococcus屬，Liu等[20]于2015年對其進行重新分類，將其歸為Vishniacozyma屬。Vishniacozyma屬酵母菌多在植物中被檢測到[21]，目前有從釀酒葡萄、落葉、果樹、土壤以及湖水中分離或鑒定到V.carnescens菌株的報道[22-27]，但是對其功能、應用，尤其是病害防治等均未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)的V.carnescensPGLY-1能顯著抑制青霉病在梨果上的擴展，該發(fā)現(xiàn)補充了用于青霉病生物防治的微生物資源，同時也是對V.carnescens應用的進一步擴展。

拮抗酵母菌主要通過營養(yǎng)物質(zhì)與空間競爭、對病原菌直接寄生、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)直接作用于病原菌、誘導寄主抗性等多個方面對病原菌進行防控[5]。目前，已經(jīng)報道的對果蔬貯運過程中的青霉病具有抑制活性的酵母菌有：淺白隱球酵母C.albidus、黏紅酵母R.glutinis、橄欖假絲酵母C.oleophila、膜醭畢赤酵母P.membranaefaciens、季也蒙邁耶氏酵母Meyerozyma guilliermondii、葡萄汁有孢漢遜酵母Hanseniaspora uvarum、擬粉紅鎖擲孢酵母Sporidiobolus pararoseus、解脂耶羅威亞酵母Yarrowia lipolytica[28-36]等。其中，淺白隱球酵母和黏紅酵母可以通過在果實表面快速定殖與病原菌進行營養(yǎng)物質(zhì)和空間競爭來抑制病原菌的擴展[28-29]。橄欖假絲酵母、膜醭畢赤酵母與季也蒙邁耶氏酵母通過與病原菌的營養(yǎng)物質(zhì)和空間競爭，以及誘導寄主抗性來抑制青霉菌[30-33]。葡萄汁有孢漢遜酵母、擬粉紅鎖擲孢酵母和解脂耶羅威亞酵母，除了通過與病原菌的營養(yǎng)物質(zhì)和空間競爭、誘導寄主產(chǎn)生抗性等方式外，還可以通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)直接作用于致病菌[34-36]。本研究分離得到的V.carnescensPGLY-1的菌懸液，在活體條件下能夠顯著抑制梨青霉病的擴展，但是菌株及其發(fā)酵液在離體條件下對青霉菌無顯著抑制作用。當植物受到外源物質(zhì)誘導或者病原菌侵染時，體內(nèi)抗性相關酶及其基因的表達增強，這些抗性相關酶的表達在果實抗真菌病害的過程中具有十分重要的作用[37-38]。因此，V.carnescensPGLY-1在果實表面的定殖，對果實抗性相關酶以及相關基因表達的影響等抗病機制值得進一步研究。