胡紀文，陳卓誠，張大準，段江磊，高 龍，林 珊，黃日雄，張秀明△

(1.廣東省深圳市羅湖醫(yī)院集團醫(yī)學檢驗中心，廣東深圳 518001；2.廣東省深圳市伯勞特生物制品有限公司，廣東深圳 518054)

1型糖尿病(T1DM)包括免疫介導和特發(fā)性兩種亞型[1]。自身免疫性糖尿病(免疫介導型)是以胰島β細胞自身免疫破壞為重要病因的一種疾病，患者體內存在一種或多種針對胰島β細胞胰島素合成、轉運和分泌的關鍵酶的自身抗體，這些自身抗體在糖尿病的預測、診斷、分型及治療方面具有重要意義[2-3]。本研究參照文獻[4]建立微陣列芯片(Array-ELISA)，用于聯(lián)合檢測T1DM組谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)、鋅轉運體8抗體(ZnT8A)、胰島細胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)5種抗體。研究報道如下。

1 資料與方法

1.1標本

1.1.1參考品血清標本來源與制備 本研究參考品原材料為不同陽性程度的血清標本和體檢者血清標本，經乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗體、艾滋病病毒抗體檢測均為陰性，用斯德潤(北京)醫(yī)療診斷用品有限公司生產的糖尿病自身抗體譜檢測試劑盒[免疫印跡法(IBT)]檢測，陽性參考品和精密度參考品按照檢測結果選擇合適的陽性血清標本混合，必要時可用陰性血清標本稀釋。陰性參考品用陰性血清標本混合。

10份陽性參考品抗體型別包含GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A、IAA，10份陰性參考品GADA、IA-2A、ICA、ZnT8A、IAA抗體全部為陰性。2份精密度參考品為R1(GADA/IA-2A/ICA/ZnT8A/IAA)、R2(GADA/IA-2A/ICA/ZnT8A/IAA)。檢測限參考品1系列用于對GADA、IA-2A、ZnT8A的最低檢測限評價，2系列用于對ICA和IAA的最低檢測限評價。檢測限參考品L3為混合陽性血清標本，必要時可用陰性血清標本稀釋，其相應抗體陽性指數(PI)范圍為1.8～2.4；L3用陰性血清標本稀釋1倍后得到對應的L2，其相應抗體PI范圍為0.9～1.2；L2用陰性血清標本稀釋1倍后得到對應的L1，其相應抗體PI范圍為0.4～0.6。

1.1.2臨床比對血清來源 選取2018年1月至2019年12月在深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院和羅湖區(qū)中醫(yī)院門診就診的T1DM患者的42份血清作為T1DM組，另選取同期在羅湖區(qū)中醫(yī)院門診就診的2型糖尿病(T2DM)患者的30份血清、體檢健康者的54份血清分別作為T2DM組、對照組。

1.2儀器和試劑

1.2.2試劑及試劑盒 96孔板(Biomat公司)；GAD65抗原/IA-2抗原(菲鵬生物)；ICA抗原/ZnT8抗原(北京華信行公司)；insulin抗原(Lee Biosolutions,Inc.)；人IgG(Equitech-Bio,Inc.)；兔抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Inc.)；抗人IgG-HRP(百美瑞生物)；HRP結合物穩(wěn)定劑(Surmodics,Inc.)；The Blocking Solution/Liquid Plate Seal(Candor Bioscience)；TMB沉淀型底物(英創(chuàng)生物)；其它化學試劑均為AR級。斯德潤(北京)醫(yī)療診斷用品有限公司生產的糖尿病自身抗體譜檢測試劑盒(IBT)，批號：010306D/0A。

1.3方法

1.3.1Array-ELISA設計 按照圖1模式圖的布局進行Array-ELISA設計，PR點為位置參考點，PC點為陽性對照點，NC點為陰性對照點，CO點為臨界值對照點，SC點為標本對照點，GAD、IA2、ICA、ZnT8、INS分別為抗原點。

圖1 糖尿病自身抗原Array-ELISA模式和實物圖

1.3.296孔Array-ELISA制備 上述各芯片點點樣液配制，用PBS(0.01 mol/L PBS，含15%甘油、10%海藻糖，pH值7.2)配制40 μg/mL的GAD抗原、60 μg/mL的IA-2抗原、10 μg/mL的ICA抗原，用Tris(0.02 mol/L Tris，含15%甘油、10%海藻糖，pH值8.5)配制20 μg/mL的ZnT8抗原，用CB(0.05 mol/L CB，含15%甘油、10%海藻糖，pH值9.6)配制80 μg/mL 的INS抗原、2 μg/mL的RAH作SC點、2 μg/mL的IgG作PR及PC點、0.12 μg/mL的IgG作CO點、0.05 μg/mL的IgG作NC點。使用BioDot AD6020芯片點樣儀按照圖1模式以每點20 nL在96孔板底部點樣，點樣結束后放入冰箱(2～8 ℃)固定16 h。次日洗板2次，加入2%的酪蛋白室溫封閉1 h，吸干封閉液，在37 ℃烘箱中干燥2 h。密封后置于4 ℃保存待用。

1.3.3檢測試驗 96孔Array-ELISA平衡至室溫后，用Tris樣品稀釋液稀釋血清26倍，取稀釋液100 μL加入反應孔中，室溫反應60 min；洗滌3次；將0.3 mg/mL的抗人IgG抗體稀釋2 000倍，每孔加入50 μL，室溫反應30 min；洗滌液3次；每孔加入TMB芯片底物50 μL，室溫反應30 min，吸取底物后，將96孔芯片放入生物芯片閱讀儀，用DM-5Abs程序進行掃描判讀，軟件統(tǒng)計各抗體的PI，PI≥1.0為陽性,PI<1.0為陰性。

1.3.4性能評價

1.3.4.1符合率 檢測10份陽性參考品和10份陰性參考品PI值結果，計算符合率。

1.3.4.2重復性 分別檢測R1、R2批內10次PI值結果，計算變異系數(CV)值。

本項目系統(tǒng)地研究了一系列可適用于野外現(xiàn)場分析的快速、簡單、高效的樣品分離富集前處理技術與便攜式鎢絲電熱原子吸收光譜儀聯(lián)用，在一定程度上提高該儀器的分析性能，對于推動該儀器走向現(xiàn)場快速分析起到了較為積極的作用，同時通過這些研究工作也進一步加強了新型分離富集技術及其與鎢絲電熱原子吸收光譜法、火焰原子吸收光譜法乃至分光光度法聯(lián)用方面的理論和應用研究。

1.3.4.3最低檢出限 L1相應抗體檢測結果應為陰性，L2相應抗體檢測結果可為陰性或者陽性，L3相應抗體檢測結果應為陽性。

1.3.5臨床應用評價 以Array-ELISA為試驗方法，糖尿病自身抗體譜檢測試劑盒(IBT)為比對方法，同步檢測3組血清標本，計算各抗體陽性符合率、陰性符合率、總符合率，Kappa值。以總符合率大于90.00%為符合率可接受的標準，Kappa值>0.75，P>0.05時為一致性較好。根據檢測結果，統(tǒng)計靈敏度、特異度，評價方法的臨床適用性。

1.3.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行數據統(tǒng)計和分析。一致性分析采用Kappa一致性檢驗，0.0≤Kappa≤0.2為微弱一致性，0.2

2 結 果

2.1陽性參考品符合率 試驗結果顯示10份陽性參考品檢測均為陽性，符合率為100.00%。

2.2陰性參考品符合率 試驗結果顯示10份陰性參考品檢測均為陰性，符合率為100.00%。

2.3重復性檢測 試驗結果顯示，樣品各抗原的批內重復性CV均小于15.00%。

2.4最低檢測限檢測 分別用檢測限參考品1系列、2系列進行5種糖尿病自身抗體檢測，各抗體PI結果顯示，L1均為陰性，L2、L3均為陽性。見表1。

2.5方法學比較 采用Array-ELISA與IBT法同步檢測T1DM組、T2DM組和對照組血清標本，GADA陽性符合率95.45%,陰性符合率94.23%，總符合率94.44%；IA-2A陽性符合率73.33%，陰性符合率100.00%，總符合率96.83%；ICA陽性符合率93.75%，陰性符合率98.18%，總符合率97.62%；ZnT8A陽性符合率100.00%，陰性符合率99.08%，總符合率99.21%；IAA陽性符合率90.91%，陰性符合率97.39%，總符合率96.83%。5種抗體的總符合率均大于90.00%。5種抗體Kappa值統(tǒng)計均大于0.75，P值均大于0.05，兩種檢測方法具有高度的一致性。見表2、3。

表1 最低檢測限檢測結果(PI)

表2 Array-ELISA與IBT法檢測血清5種抗體結果(n)

表3 Array-ELISA與IBT法檢測血清5種抗體結果一致性比較(%)

2.6臨床應用評價 使用本研究所建立的糖尿病自身抗體Array-ELISA檢測試劑盒對3組血清5種抗體進行檢測，T1DM組5種抗體的陽性率高于T2DM組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。Array-ELISA檢測T1DM 5種抗體的靈敏度除GADA為59.52%較高外，其余4種自身抗體指標的靈敏度均低于50.00%。但5種抗體聯(lián)合檢測T1DM的靈敏度達88.10%，特異度為90.70%，見表5。

表4 Array-ELISA檢測3組血清5種抗體的結果[ n(%)]

表5 Array-ELISA檢測T1DM 5種自身抗體的效果評價(%)

3 討 論

在T1DM發(fā)病前、發(fā)病早期和發(fā)病后會產生許多自身抗體，直到目前為止，與T1DM相關的自身抗體仍不斷被發(fā)現(xiàn)。通過大量的研究，人們已經清楚地認識到，要確切地診斷T1DM，僅一種自身抗體指標的預測能力是非常有限的。研究表明，聯(lián)合多種抗體測定可提高胰島自身抗體的檢出率[5]。謝志國等[6]報道，在新診斷的T1DM患者中，單獨檢測GADA陽性率為70.2%(144/205)；聯(lián)合檢測GADA+IA-2A，任一抗體陽性者166例，陽性率提高至81.0%(與GADA單獨檢測相比，P<0.05)；在檢測GADA和IA-2A的基礎上，進一步聯(lián)合檢測ZnT8A，任一抗體陽性者為170例，陽性率進一步提高至82.9%，但與 GADA+IA-2A聯(lián)合檢測相比，陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。研制并應用可實現(xiàn)多種胰島自身抗體聯(lián)合檢測的方法有重要的臨床意義，可減少T1DM尤其是臨床特征不典型的T1DM患者的漏診[7]。本研究研制的糖尿病自身抗體檢測試劑盒Array-ELISA可同時檢測ICA、IAA、GADA、IA-2A和ZnT8A 5種抗體，對42例臨床確診T1DM患者血清標本進行檢測，5種抗體聯(lián)合檢測的靈敏度為88.10%，特異度為90.70%，陽性檢測結果可以有效鑒別診斷T1DM，指導臨床精準治療。

糖尿病自身抗體的測定方法主要包括免疫組化法、放射免疫分析法(RIA)、ELISA、IBT、化學發(fā)光法(CLIA)、放射配體分析法(RBA)等。其中免疫組化法具有準確度高、特異度強、重復性好且直觀的特點，但由于操作繁瑣耗時已逐漸被ELISA替代。RIA是一種十分經典的方法，較早應用于胰島自身抗體的測定，具有較高的靈敏度和特異度，但是由于存在放射性污染，目前臨床已經很少使用。ELISA是應用較成熟的一種方法，可得到較可靠的結果，但利用該法進行多指標聯(lián)合測定則存在檢測費時、報告周期較長等不足。IBT結合了聚丙烯酰凝膠電泳的高分辨率和免疫標記技術的高特異度及靈敏度的優(yōu)點，近年來開始應用于胰島自身抗體的測定，該方法簡便，可一次同時測定幾種自身抗體，其特異度好，但靈敏度也有待提高[8-9]。CLIA是近年發(fā)展起來的檢驗方法之一，具有高通量、高特異度及靈敏度、檢測速度快等優(yōu)點，但一次只能檢測一個抗體。多年來的標準化工作證實，RBA因其靈敏度和特異度高，結果重現(xiàn)性好，檢測線性范圍寬，被歐美發(fā)達國家認定為胰島自身抗體檢測的參考方法(金標準)[10]，但該方法操作復雜，檢測步驟多，影響因素多，并不適合臨床檢測。因此，發(fā)展準確快速、靈敏特異、并可以同時測定多指標的新技術和新方法非常必需。本研究研制的糖尿病自身抗體檢測試劑盒Array-ELISA與IBT相比，兩種方法均可以檢測5種自身抗體，同時對臨床標本進行檢測，5種自身抗體的總符合率均在90.00%以上，Kappa值均大于0.75，兩種方法具有高度一致性。

目前有部分檢測試劑可以在診斷DM基礎上初步分型，如英國RSR(GADA、IA-2A、ZnT8A)免疫放射IRMA試劑盒、德國MedipanGmbh(GADA、IA-2A)ELISA檢測試劑盒、美國Biomerica(GADA、IAA、ICA)ELISA檢測試劑盒，國內深圳市伯勞特公司糖尿病分型試劑盒(IBT法)、深圳賽爾(GADA、IAA、ICA)ELISA檢測試劑盒、斯德潤(北京)醫(yī)療診斷用品有限公司生產的糖尿病自身抗體譜檢測試劑盒。相比于現(xiàn)有試劑盒，本研究制備的試劑盒采用Array-ELISA技術，應用標準96孔板作為固相，兼容各種酶標洗板機及自動酶免分析系統(tǒng)，解決了手工操作印跡膜條的操作復雜、重復性差、均一性差等問題，同時又具有高通量的特點。檢測結果由生物芯片閱讀儀自動判讀，檢測結果客觀，避免人工肉眼判斷的主觀性，更加適用于臨床上對糖尿病自身抗體的檢測，有效輔助糖尿病的分型診斷，從而實現(xiàn)T1DM患者的早期正確診斷。