陳洪衛(wèi)，侯彥強(qiáng)

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201600)

膿毒癥發(fā)生時(shí)毛細(xì)血管的通透性增加，形成第三間隙液體引起組織水腫(如肺泡水腫)，造成組織的氧交換障礙。有研究資料顯示，嚴(yán)重膿毒癥患者，毛細(xì)血管滲漏綜合征(CLS)的發(fā)生率幾乎達(dá)100%，并且CLS的持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，多器官功能障礙綜合征發(fā)生率和病死率也越高[1]。另有研究表明，CLS的發(fā)生同血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[2]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者其血清誘騙受體3(DcR3)表達(dá)會(huì)升高。DcR3是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體的新成員，是一類(lèi)可以和腫瘤壞死因子超家族第14個(gè)成員(LIGHT)、死亡因子配體(FasL)及腫瘤壞死因子配體相關(guān)分子1A(TL1A)特異性結(jié)合的受體蛋白，從而阻斷該配體誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡。DcR3與多種腫瘤性及炎性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但DcR3在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮何種作用尚不清楚[3-4]。因此，本研究通過(guò)觀察過(guò)表達(dá)或干擾DcR3對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，探討CLS的發(fā)生機(jī)制和防治策略。

1 材料與方法

1.1主要試劑 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；脂多糖(LPS)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒增強(qiáng)綠色熒光蛋白(pEGFP)-DcR3和DcR3小干擾RNA(siRNA)由上海和元生物技術(shù)公司合成，DcR3 siRNA序列為： Sense5′-UCGACUUUGUGGCUUUCCA-3′,Antisense5′-UGGAAAGCCAC AAAGUCGA-3′;胱天蛋白酶(Caspase)3和Cleave PARP抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 -80 ℃冰箱中取出人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凍存管，迅速放入37 ℃水浴中，不停搖動(dòng)，使其在1 min內(nèi)融化，無(wú)菌條件下吸出細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞瓶時(shí)，進(jìn)行傳代，棄去舊培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液漂洗一次，再加入1.5 mL胰酶消化，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓、間隙增大時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基終止反應(yīng)，反復(fù)吹打細(xì)胞重懸，1∶3轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞處理 將細(xì)胞分成6組：正常對(duì)照組、單純LPS刺激組、LPS+siRNA DcR3組、LPS+siRNA對(duì)照組、LPS+pEGFP-DcR3組和LPS+pEGFP對(duì)照組，分別置于6孔板中培養(yǎng)，調(diào)整并計(jì)數(shù)，使各孔含有106個(gè)細(xì)胞，每個(gè)處理重復(fù)3次。具體處理如下：細(xì)胞貼壁后12 h，正常對(duì)照組和單純LPS刺激組先不做任何處理；LPS+siRNA DcR3組和LPS+pEGFP-DcR3組利用Liporin2000轉(zhuǎn)染25 nmol/L DcR3 siRNA和pEGFP-DcR3進(jìn)行預(yù)處理；LPS+siRNA對(duì)照組和LPS+pEGFP對(duì)照組轉(zhuǎn)染相同劑量的siRNA和pEGFP進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理48 h后，除正常對(duì)照組外，其余各組均加入10 μg/mL LPS刺激細(xì)胞，24 h后，收集細(xì)胞上清液及細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 用總RNA提取試劑(Trizol)裂解細(xì)胞抽提總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR green法對(duì)DcR3 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。DcR3特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。收集每個(gè)PCR延伸期的熒光，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線檢測(cè)特異性，經(jīng)SDS2.2軟件分析循環(huán)閾值(Ct)值。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的表達(dá)水平，其中ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5蛋白免疫印跡(Western blot) 使用RIPA裂解細(xì)胞，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后，取50 μg蛋白，水浴煮沸10 min后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂蛋白室溫封閉2 h，加入適量的DcR3、Caspase3和β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，0.1%的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗3次，每次5 min。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗3次，每次5 min。結(jié)果用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)，X光膠片曝光、顯影、定影、觀察結(jié)果。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞處理后，用Annexin V-FITC Apoptosis Dection kit (Bection Dickinson 美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1siRNA干擾后細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3組，第1組為48 h正常對(duì)照組，第2組為48 h LPS+siRNA對(duì)照組，第3組為48 h LPS+siRNA DcR3組。定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，LPS+siRNA對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.003±0.098vs. 0.928±0.096和0.333±0.012vs. 0.375±0.020，P>0.05)，而LPS+siRNA DcR3組細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降(1.003±0.098vs. 0.536±0.028和0.333±0.012vs. 0.101±0.016)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A為細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以2-ΔΔCt表示；B為細(xì)胞內(nèi)DcR3蛋白的表達(dá)水平；C為DcR3與內(nèi)參actin的灰度比。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2DcR3過(guò)表達(dá)處理后細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平 試驗(yàn)共設(shè)置3組，第1組為48 h正常對(duì)照組，第2組為48 h LPS+pEGFP對(duì)照組，第3組為48 h LPS+pEGFP-DcR3組。定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，LPS+pEGFP對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.005±0.079vs. 0.974±0.086和0.298±0.015vs. 0.299±0.017，P>0.05)，而LPS+pEGFP-DcR3組細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(1.005±0.079vs. 2.178±0.021和0.298±0.015vs. 0.437±0.019)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3siRNA DcR3對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其凋亡率從誘導(dǎo)前的(10.10±0.09)%增至(31.80±0.15)%，siRNA DcR3表達(dá)對(duì)此有加強(qiáng)作用，可使LPS誘導(dǎo)的HUVEC凋亡明顯增加，凋亡率從(31.80±0.15)%增至(42.70±0.23)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白同樣顯示，LPS可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Cleave PARP表達(dá)較正常對(duì)照組增加(P<0.05)，siRNA DcR3表達(dá)對(duì)此有加強(qiáng)作用，可使細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Cleave PARP表達(dá)較單純LPS刺激組增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A為細(xì)胞內(nèi)DcR3 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以2-ΔΔCt表示；B為細(xì)胞內(nèi)DcR3蛋白的表達(dá)水平；C為DcR3與內(nèi)參actin的灰度比。與正常對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.4DcR3過(guò)表達(dá)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其凋亡率從誘導(dǎo)(10.10±0.09)%增至(31.80±0.15)%，DcR3過(guò)表達(dá)對(duì)此有明顯抑制作用，可使凋亡率從(31.80±0.15)%降至(21.50±0.16)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白同樣顯示，LPS可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Cleave PARP表達(dá)較正常對(duì)照組增加 (P<0.05)，DcR3過(guò)表達(dá)對(duì)此有抑制作用，可使細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Cleave PARP表達(dá)較單純LPS刺激組降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；B為Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平；C為Western blot結(jié)果中蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比。與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與單純LPS刺激組相比，#P<0.05。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；B為Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平；C為Western blot結(jié)果中蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比。與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與單純LPS刺激組相比，#P<0.05。

3 討 論

細(xì)胞凋亡在膿毒癥發(fā)病過(guò)程中越來(lái)越受到人們的重視，特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的微血管通透性增高，這是器官功能受損的重要特征之一[5]。內(nèi)皮細(xì)胞是膿毒癥誘導(dǎo)事件的主要目標(biāo)且內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在膿毒休克病理學(xué)中占重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體首先接觸循環(huán)中細(xì)菌的細(xì)胞之一[6-7]。膿毒癥時(shí)細(xì)菌首先通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞表面的識(shí)別受體啟動(dòng)炎性介質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞的高反應(yīng)可能造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、死亡或間隙改變，使得內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，導(dǎo)致組織、器官水腫及發(fā)生相應(yīng)的功能障礙，臨床上表現(xiàn)為CLS[8]。血管壁內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和脫落是血管損傷的重要標(biāo)志，也是CLS發(fā)生的重要因素之一。因此，降低膿毒癥時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可能對(duì)改善毛細(xì)血管功能有重要意義。

DcR3是新近發(fā)現(xiàn)的一種與凋亡密切相關(guān)的抗凋亡分子，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FasL、LIGHT和TL1A 3種腫瘤壞死因子超家族配體，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)過(guò)表達(dá)DcR3能夠保護(hù)放線菌酮誘導(dǎo)的單核細(xì)胞凋亡[11]，而干擾DcR3表達(dá)可以促進(jìn)胰腺癌腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清中DcR3表達(dá)水平升高，DcR3作為一個(gè)抗炎、抗凋亡因子，其表達(dá)水平升高可能是機(jī)體的一個(gè)防御機(jī)制。為了進(jìn)一步證實(shí)DcR3在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究以體外培養(yǎng)的HUVEC為模型，以?xún)?nèi)毒素作為刺激物，通過(guò)過(guò)表達(dá)及干擾DcR3觀察細(xì)胞的凋亡情況。

結(jié)果顯示，HUVEC內(nèi)DcR3在正常培養(yǎng)狀態(tài)下即存在一定的表達(dá)率，siRNA DcR3預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)DcR3表達(dá)明顯被抑制，LPS可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞凋亡率從誘導(dǎo)前的(10.1±0.09)%增至(31.8±0.15)%，抑制DcR3表達(dá)能夠加強(qiáng)LPS的誘導(dǎo)作用，LPS+siRNA DcR3組細(xì)胞凋亡明顯高于單純LPS刺激組(P<0.05)。而LPS+pEGFP-DcR3組細(xì)胞內(nèi)DcR3表達(dá)明顯升高，流式和Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況顯示，過(guò)表達(dá)DcR3能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可使凋亡率降至(21.5±0.16)%。

4 結(jié) 論

膿毒癥時(shí)存在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，DcR3在膿毒癥引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起重要作用，過(guò)表達(dá)DcR3能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)結(jié)果在膿毒癥的治療和預(yù)后判斷中具有潛在研究?jī)r(jià)值，尚需進(jìn)一步證實(shí)。