劉閃閃，魏釗陽,陳硯美，甘喜武，付 軍，張萬舉

(1. 黃岡師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湖北 黃岡 438000; 2. 黃岡市教育局，湖北 黃岡 438000； 3. 湖北省黃岡中學(xué)，湖北 黃岡 438000)

物質(zhì)的純度是反映物質(zhì)品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，例如生活中離不開的食用級(jí)食鹽、實(shí)驗(yàn)室中的分析純化學(xué)藥品、治病所用的醫(yī)學(xué)藥品及生產(chǎn)計(jì)算機(jī)芯片所需的高純硅等都對(duì)物質(zhì)的純度有很高要求，因此研究物質(zhì)的分離提純方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。基于物質(zhì)的物理性質(zhì)及生化性質(zhì)的差異對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離提純是中學(xué)化學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)探究活動(dòng)中的一個(gè)重要指導(dǎo)思想，具體的一些分離提純操作包括過濾、滲析、結(jié)晶、萃取、蒸餾等。利用過濾操作，我們可以提純含有少量泥沙的粗鹽；利用重結(jié)晶，我們可以分離含有少量氯化鉀的硝酸鉀粉末；利用萃取操作，我們可以提取碘水中的碘等。在氫氧化鐵膠體的制備實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)我們想要除去氫氧化鐵膠體中的未完全反應(yīng)的氯離子時(shí)，可以通過滲析操作，利用半透膜對(duì)氯離子的選擇性透過，達(dá)到凈化提純膠體的目的。那如果想要除去一名腎功能惡化的尿毒癥患者的血液中的代謝廢物，可以采取什么辦法呢？血液透析！血液透析就是利用滲析的原理，將血液看做膠體，將血液中的代謝廢物和電解質(zhì)看做可以透過半透膜的小分子或離子，通過滲析操作，將代謝廢物分離并清除，從而發(fā)揮人工腎臟的作用。由此可見，我們看似簡單的化學(xué)知識(shí)卻能發(fā)揮治病救人的大本領(lǐng)，為人們的生命健康做出重要貢獻(xiàn)。

提到生命健康，惡性腫瘤總是一個(gè)繞不開的話題。在癌癥治療過程中，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是最常見的標(biāo)志病情惡化的醫(yī)學(xué)現(xiàn)象，這個(gè)現(xiàn)象與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)有密切關(guān)系。CTCs是從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤脫離并進(jìn)入到外周血的腫瘤細(xì)胞，是主要的癌癥標(biāo)志物之一[1-2]。而且，CTC的檢測(cè)僅需抽取幾毫升血液，檢測(cè)方便、無創(chuàng)，成為診斷腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移最直接和重要的方法。但是存在于外周血中的CTCs個(gè)數(shù)極少，每105～107個(gè)血細(xì)胞僅含有一個(gè)CTC[3-4]，且經(jīng)歷了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTCs表型蛋白種類復(fù)雜、生命力及轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)，這些特征嚴(yán)重限制了CTCs的識(shí)別、富集及檢測(cè)。因此，亟待發(fā)展準(zhǔn)確率高的低豐度CTCs分選富集新方法。那么，如何分離富集外周血樣品中的低豐度循環(huán)腫瘤細(xì)胞呢？從中學(xué)學(xué)習(xí)的物質(zhì)分離方法可以找到答案嗎？過濾！我們把外周血看做氯化鈉溶液，將外周血中含有的極少個(gè)數(shù)的CTCs看做泥沙，利用他們尺寸大小的差異達(dá)到分離的目的。但是，泥沙肉眼可見，而CTCs的尺寸只有幾十微米，并且，我們還需要對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)分析、蛋白質(zhì)組化信息收集、耐藥性研究等后續(xù)操作。單純用簡單的過濾裝置無法滿足我們的需求，因此，科學(xué)家們發(fā)展了諸多分離純化技術(shù)并應(yīng)用于生命體系中雜志物質(zhì)的有效分離和疾病標(biāo)志物的富集檢測(cè)，如構(gòu)建微流控芯片分離富集癌癥病人外周血樣品中的低含量循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

微流控芯片的概念起源于1990年瑞士科學(xué)家提出的微全分析系統(tǒng)，是一種在微米級(jí)尺度上對(duì)微量流體進(jìn)行分析和處理的技術(shù)。微流控芯片以生化分析為基礎(chǔ)，依托微機(jī)電加工技術(shù)和微管道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)在微小芯片上完成采樣、稀釋、反應(yīng)及檢測(cè)等常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)[5]。相比較于傳統(tǒng)的物質(zhì)分離富集方法，微流控芯片具有微型化、集成化、自動(dòng)化及高效率等優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)、生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物篩選、食品分析、司法鑒定等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。自2015年美國總統(tǒng)奧巴馬提出“精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃”后，微流控芯片在生命科學(xué)領(lǐng)域尤其是細(xì)胞富集檢測(cè)的應(yīng)用研究得到了更廣泛的推廣。

1 基于微流控芯片的細(xì)胞富集分離方法

研究物質(zhì)性質(zhì)，探究反應(yīng)規(guī)律，基于此選擇物質(zhì)分離檢測(cè)方法。因此，高效分離富集CTCs離不開對(duì)其理化性質(zhì)的深度了解。研究對(duì)象CTCs與其共存物的主要差異包括兩大方面，物理性質(zhì)和生化性質(zhì)。物理性質(zhì)的主要差異是CTCs比其他共存細(xì)胞如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等的尺寸大，其他密度、力學(xué)、介電性質(zhì)、變形性都有差異。因此根據(jù)物理性質(zhì)的差異，選擇物質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)而具體設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除了物理方法之外，掌握CTCs與正常細(xì)胞的生化性質(zhì)差異也可利于發(fā)展新的分離富集方法。相比于正常細(xì)胞，CTCs細(xì)胞膜表面表達(dá)大量的上表皮粘附因子及細(xì)胞角蛋白等抗原，而正常細(xì)胞則不表達(dá)這些抗原?？乖c抗體可以特異性識(shí)別，利用這種差異，在過濾裝置中引入抗體，CTCs就可被抗體牢牢抓住，其他細(xì)胞順利通過芯片通道，從而達(dá)到與其他細(xì)胞正常分離以及富集CTCs的目的。

2 基于物理性質(zhì)差異的分離法

含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外周血樣品的主要成分包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和少量CTCs。CTCs的細(xì)胞直徑為13～25 μm，比紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的體積大，因此可基于細(xì)胞尺寸的差異，通過在微流控芯片上設(shè)計(jì)孔徑合適的過濾裝置達(dá)到分離富集的效果[6]，實(shí)現(xiàn)低成本、快速、簡便的高通量檢測(cè)方法。

Chen等[7]基于PDMS利用光刻蝕技術(shù)設(shè)計(jì)直徑大約18～22 μm, 深度5～8 μm的三維孔洞結(jié)構(gòu)的微流控芯片分離富集外周血樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。但是，體積較小的干擾共存物在重力及渦旋外力的作用下有較大可能優(yōu)先占據(jù)孔洞，從而導(dǎo)致了目標(biāo)細(xì)胞的流失，得到較低純度的目標(biāo)細(xì)胞樣品。為了避免目標(biāo)細(xì)胞的流失，Tan等[8]構(gòu)建月牙形微陣列模式，月牙錯(cuò)位排列，留出5 μm寬度縫隙，從而有效截留大體積的目標(biāo)CTCs細(xì)胞。由于外周血樣品中同樣存在個(gè)別體積較大的白細(xì)胞等，因此該方法截留的目標(biāo)細(xì)胞樣品純度也會(huì)受到影響。此外，基于細(xì)胞尺寸大小的多數(shù)過濾式微流控芯片在工作過程中會(huì)由于濾膜堵塞及流動(dòng)壓力而破壞細(xì)胞活性，進(jìn)而影響后續(xù)分析。

Zhou等[9]構(gòu)建雙層過濾芯片(圖1)，精細(xì)設(shè)計(jì)孔洞大小、排列間距及層間隙，使得小體積的白細(xì)胞、紅細(xì)胞等物質(zhì)通過小規(guī)格孔洞進(jìn)入層間隙，從而與大體積循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離，層間空隙的存在極大的減小了芯片中通過的液體縮產(chǎn)生的壓力，進(jìn)而有效保護(hù)截留的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的活性。

圖1 微流控芯片裝置橫切圖及單元模型三維視圖Fig. 1 Crosscutting diagram of microfluidic chip device and three-dimensional view of unit model

Loutherback等[10]基于流體力學(xué)設(shè)計(jì)了確定性側(cè)向位移芯片(圖2)，在左側(cè)入口處注入外周血樣品，各成分沿通道從左向右移動(dòng)，在移動(dòng)過程中，不同尺寸的細(xì)胞受到的阻力和側(cè)向位移力不同。在這些力的綜合作用下，較大體積的細(xì)胞橫向移動(dòng)到通道一側(cè)，較小體積的紅細(xì)胞及白細(xì)胞沿著流體方向正常移動(dòng)，最終實(shí)現(xiàn)分離富集CTCs的目的。此外，利用不同成分的介電常數(shù)性質(zhì)的差異，在外電場(chǎng)作用下也可以實(shí)現(xiàn)CTCs的分離富集。

圖2 基于確定性側(cè)向位移構(gòu)建微流控芯片原理圖Fig. 2 Schematic diagram of microfluidic chip based on deterministic lateral displacement

上述這些工作都是利用CTCs的物理性質(zhì)差異進(jìn)行分離富集，但是通過對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的把控和得到的結(jié)果的分析對(duì)比，總結(jié)出了利用物理性質(zhì)差異進(jìn)行分離的兩個(gè)固有缺點(diǎn)：一是外周血樣品中存在的白細(xì)胞往往體積也較大，其細(xì)胞直徑范圍與CTCs常有重疊，因此僅通過細(xì)胞尺寸大小差異設(shè)計(jì)芯片截留的細(xì)胞樣品純度難以保證；二是CTCs 的變形性大，在外力作用下極有可能發(fā)生變形從而通過小孔道流失，造成假陰性結(jié)果。基于上述結(jié)果的分析討論，我們可以得出結(jié)論，單純利用物理性質(zhì)差異分離富集的效果有待提高。為了提高分離的準(zhǔn)確率和收集的細(xì)胞樣品純度，我們需要在過濾裝置中錨定具有特異性識(shí)別和捕獲能力的物質(zhì)，利用細(xì)胞表面表達(dá)蛋白的特殊性進(jìn)行分選。

3 基于生物性質(zhì)的親和分離法

從腫瘤組織脫落而進(jìn)入到外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，細(xì)胞膜表面表達(dá)較多的上表皮粘附因子(Epithelial Cellular Adhesion Molecule, EpCAM)，外周血中白細(xì)胞表現(xiàn)CD45高表達(dá)[11]，因此可基于這些標(biāo)志物的表達(dá)差異對(duì)CTCs進(jìn)行有效分選。

Adams等[12]利用修飾了羧酸基團(tuán)的甲基丙烯酸甲酯制備表面粗糙的芯片基底，通過酰胺縮合反應(yīng)連接anti-EpCAM抗體制備高通量微流控芯片，當(dāng)外周血樣品經(jīng)過微流控芯片時(shí)，芯片上修飾的anti-EpCAM抗體與液體樣品中表達(dá)了EpCAM抗原的細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的分選富集。該法的細(xì)胞分離效果明顯高于單純利用細(xì)胞尺寸差異的分離方法，但外周血樣品流經(jīng)芯片時(shí)，受外力作用，部分細(xì)胞會(huì)處于中流層更甚者于上層，處于中流層及上流層的細(xì)胞將難以于芯片上的抗體接觸，無法被芯片表面抗體順利捕獲，這將顯著降低CTCs的回收率。為了提高捕獲率，Wang等[13]利用氫氟酸刻蝕工藝制備硅納米孔基底，在硅納米柱上修飾anti-EpCAM抗體，增加抗體與細(xì)胞的接觸機(jī)率，從而達(dá)到分選富集的目的。相比較于平板硅片基底，該方法中的納米柱基底對(duì)細(xì)胞的捕獲效率增加了十倍左右。Stoot[14]等構(gòu)建魚骨形芯片，利用非對(duì)稱通道及非均勻深度溝壑產(chǎn)生的渦流增加細(xì)胞與抗體的接觸機(jī)率，達(dá)到93%的回收率。

利用細(xì)胞表面的EpCAM與芯片修飾的抗體的特異性識(shí)別進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，通常會(huì)存在假陰性現(xiàn)象。由于腫瘤細(xì)胞在入侵血管和淋巴系統(tǒng)時(shí)，會(huì)經(jīng)歷上皮-間葉轉(zhuǎn)換(Epithelial Mesenchymal Transitions，EMT)過程，使得細(xì)胞表面的上皮組織標(biāo)志物下調(diào)或者缺失，取而代之的是更多表達(dá)間葉組織標(biāo)志物，因此單純利用EpCAM與抗體識(shí)別作用的捕獲效果嚴(yán)重受限。為了解決這一現(xiàn)實(shí)問題，研究學(xué)者們巧妙利用了核酸適配體設(shè)計(jì)微流控芯片。核酸適配體(Aptamer)是一種具有高親和力可特異性識(shí)別目標(biāo)物的寡核苷酸單鏈，它具有合成簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、與目標(biāo)物結(jié)合力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。Sheng 等[15]在微流控芯片通道中連接修飾了核酸適配體的金納米顆粒用于捕獲CTCs, 得到了高于90%的分選富集效率。Sheng等[16]在含有59000個(gè)以上的微米柱的基底材料上修飾核酸適配體捕獲CTCs，目的細(xì)胞的捕獲率達(dá)到95%(圖3)。

圖3 基于核酸適配體的微流控芯片的構(gòu)建Fig. 3 Schematic diagram of microfluidic chip based on aptamer

微流控芯片在分離富集及檢測(cè)外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞方面發(fā)揮著重要的作用，這也已經(jīng)成為檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的最可靠方法之一。微流控芯片是一種重要的新一代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，特別是在生物傳感、藥物篩選、組織工程、人體器官修復(fù)、靶向治療等領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用。

4 總結(jié)與展望

循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集對(duì)癌癥的無痛檢測(cè)、預(yù)后分析和個(gè)性化治療具有重要意義。結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞的理化性質(zhì)和分離純化技術(shù)，本文列舉了微流控芯片在循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選富集方面的突出成果及研究進(jìn)展。微流控芯片如同一個(gè)根據(jù)目標(biāo)物的特殊性質(zhì)而設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)精細(xì)、功能多樣化的微量自動(dòng)化過濾裝置，科研工作者們從問題出發(fā)，分析目標(biāo)物的理化性質(zhì)，基于此對(duì)微流控芯片進(jìn)行的巧妙設(shè)計(jì)，從而在人類生產(chǎn)、生活和生命醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更大作用，推動(dòng)化學(xué)科學(xué)在人類健康方面展現(xiàn)重要價(jià)值。