董瑤 呂琳曦 關(guān)麗娜 王朝莉 馮莉 謝勇恩

川北醫(yī)學(xué)院免疫與分子生物學(xué)研究所（四川南充637000）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）是不動桿菌種屬中一種常見的條件致病菌。它能引起多部位感染，如肺部、尿路感染及皮膚、傷口等部位的感染等［1］，對免疫功能低下以及使用機械通氣、氣管插管、尿路插管等輔助治療手段的患者威脅較大，特別是居住在ICU中的重癥患者［2］。由于鮑曼不動桿菌能在非生物表面形成生物膜和抗干燥的能力［3］，以及能侵襲人上皮細胞［4］，使得它能在環(huán)境中長期生存。近年來，鮑曼不動桿菌多重耐藥性菌株感染日漸增多，使其有效防治面臨巨大挑戰(zhàn)［5-6］。因此，亟需尋找強有力的綜合性防治措施。疫苗接種是控制病原微生物感染的一種有效手段，鮑曼不動桿菌候選疫苗研究也成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點之一［7-9］。

本研究通過分子克隆技術(shù)將鮑曼不動桿菌三種抗原基因，即smpA基因、omp22基因及nlpA基因5′端384 bp片段進行融合獲得融合基因，將其克隆到質(zhì)粒載體pColdI中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdI?SON，并將表達純化的重組蛋白作為抗原免疫小鼠，檢測該重組融合蛋白的免疫原性，為進一步探討其免疫保護性等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株和質(zhì)粒Balb/c雌性小鼠購買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，鮑曼不動桿菌ATCC19606由本實驗室保存，大腸桿菌E.coli BL21菌株及質(zhì)粒載體pColdI購自Takara公司。

1.1.2 主要試劑PrimerStar Max試劑盒購自Takara公司，質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Bradford蛋白定量檢測試劑、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ、Ni?Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自上海生工生物工程公司，完全/不完全弗氏佐劑購自Sigma公司，動物脾臟組織淋巴細胞分離試劑盒、CCK?8增殖活性檢測試劑盒、IFN?γ及IL?4測定試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pColdI-SON 的構(gòu)建及鑒定攜帶smpA/omp22/nlpA三種抗原基因完整編碼區(qū)序列和相應(yīng)連接區(qū)序列的質(zhì)粒pcDNA3.1?SON由上海生工生物工程公司協(xié)助合成和構(gòu)建，以此質(zhì)粒為模板，通過自行設(shè)計的引物（上游引物：5′?GCGG?TACCATGCAAAAACTCGTGCTGACG?3′和下游引物5′?GCGTCGACTTAATTTGCATAAATACCCATTGG?3′）進行PCR擴增獲得包含smpA、omp22基因完整編碼區(qū)序列及nlpA基因5′端384個堿基的融合基因片段（其編碼區(qū)總長度為1 485 bp），將其定向克隆入原核表達質(zhì)粒pColdI，對重組質(zhì)粒進行酶切和DNA測序鑒定。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化分別挑取含重組質(zhì)粒及含pColdI空載體的E.coli BL21單菌落接種含100 μg/mL氨芐青霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，分別加入終濃度為1、2、5 mmol/L的IPTG，調(diào)節(jié)為15 ℃恒溫誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。取上述菌液1 mL離心收集菌體與等量2×SDS凝膠加樣緩沖液混合后進行SDS?PAGE電泳，分析誘導(dǎo)表達情況。將含pColdI?SON的E.coli BL21單菌落接種200 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，以上述最優(yōu)條件誘導(dǎo)表達后，離心收集菌體，用30 mL Binding washing Buffer將細菌重懸。超聲波粉碎機冰浴裂解細胞20 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。離心后的上清和沉淀分別做SDS?PAGE，以確定純化方法。按照Ni?Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書對重組蛋白進行純化。

1.2.3 重組蛋白的Western blot 鑒定將保存的純化重組蛋白與相應(yīng)的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌全菌蛋白經(jīng)SDS?PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 ～3 h，充分洗膜后加入經(jīng)封閉液稀釋1 000倍的抗6×His標(biāo)簽抗體，4 ℃孵育過夜，充分洗膜后再加入經(jīng)封閉液稀釋5 000倍的HRP?羊抗鼠IgG孵育2 h，以Boster公司的DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.4 免疫接種Balb/c 小鼠將18只6 ～8周齡的雌性Balb/c小鼠隨機分為3組（每組6只），即：重組蛋白免疫組、佐劑對照組、PBS對照組。重組蛋白免疫組每只小鼠注射入20 μg重組融合蛋白（溶于100 μL PBS）與等體積的弗氏佐劑混合；佐劑組每只小鼠注射100 μL佐劑，PBS對照組每只小鼠注射100 μL PBS緩沖溶液。首次免疫后第14、28 d分別以上述劑量各加強免疫1次。末次免疫第7、21天進行內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，于-80 ℃保存。

1.2.5 ELISA 檢測血清抗體滴度以200 ng重組蛋白包被，4 ℃過夜。次日用封閉液37 ℃封閉3 h，加入連續(xù)兩倍稀釋的抗血清樣本，37 ℃孵育1 h，再分別加入稀釋倍數(shù)為1∶10 000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育2 h后加入TMB避光顯色30 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定450 nm處OD值。以樣品測定孔比PBS對照孔比值2.1的最高稀釋倍數(shù)為待測血清的抗體滴度。

1.2.6 脾淋巴細胞增殖實驗?zāi)┐尾裳筇幩佬∈螅瑹o菌條件下分離脾臟組織，利用小鼠脾組織淋巴細胞分離試劑盒分離脾淋巴細胞，以純化的重組蛋白刺激24 h后，CCK?8試劑盒測定細胞增殖活性。以細胞刺激指數(shù)（SI）判斷淋巴細胞增殖活性（SI=待測孔OD450/對照孔OD450）

1.2.7 脾淋巴細胞IFN-γ、IL-4 測定脾淋巴細胞經(jīng)重組蛋白刺激培養(yǎng)72 h后，收集上清，離心去除顆粒沉淀后分別用IFN?γ及IL?4試劑盒測定脾淋巴細胞培養(yǎng)液中IFN?γ、IL?4的產(chǎn)生情況（具體操作按試劑盒說明書進行）。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR擴增獲得約1 500 bp的基因片段，將其定向克隆入pColdⅠ后獲得了大小為5.9 kb的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和SalⅠ酶雙酶切可釋放出大小約為1 500 bp的插入片段，初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并將其命名為pColdI?SON（圖1），DNA測序結(jié)果亦表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis identified by recombinant plasmid digestion

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定以不同濃度的IPTG誘導(dǎo)重組菌后，經(jīng)SDS?PAGE電泳確定出最優(yōu)的IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mmol/L，從200 mL培養(yǎng)液中收集重組菌，經(jīng)超聲裂解后用鎳親和純化柱純化到分子量約為56 kDa的重組蛋白（圖2），蛋白濃度為1.8 mg/mL。Western blot分析表明該重組蛋白能被抗6×His標(biāo)簽抗體特異性識別（圖3）。

圖2 重組蛋白的SDS?PAGE 分析Fig.2 SDS?PAGE analysis of recombinant protein

圖3 重組蛋白的Wstern blot 檢測（抗6×His 標(biāo)簽抗體）Fig.3 Wstern blot detection of recombinant protein

2.3 血清抗體滴度檢測重組蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生了較強的免疫應(yīng)答，血清中可檢出較高滴度的抗原特異性IgG抗體（圖4），而佐劑對照組及PBS對照組血清中未檢測到相應(yīng)的抗原特異性抗體。

圖4 重組蛋白免疫小鼠抗血清滴度檢測（n=6）Fig.4 Antiserum titer detection of mice immunized with recombinant protein（n=6）

2.4 脾淋巴細胞增殖活性用CCK?8試劑盒檢測脾淋巴細胞增殖活性，結(jié)果顯示，脾淋巴細胞經(jīng)重組融合蛋白刺激培養(yǎng)后，重組融合蛋白免疫小鼠脾細胞的增殖活性顯著高于佐劑及PBS對照組（P ＜0.001，圖5）。

圖5 脾淋巴細胞增殖活性檢測結(jié)果（n=6）Fig.5 Results of detection of splenic lymphocyte proliferation activity（n=6）

2.5 IFN-γ及IL-4 分泌水平檢測脾淋巴細胞經(jīng)重組融合蛋白刺激培養(yǎng)72 h后，重組融合蛋白免疫組小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生比對照組更高水平的IL?4（P ＜0.01，圖6），而各組間IFN?γ分泌水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05，圖7）。

圖6 脾淋巴細胞經(jīng)抗原刺激后IL-4 分泌水平（n=6）Fig.6 IL?4 secretion level of splenic lymphocytes stimulated by antigen（n=6）

圖7 脾淋巴細胞經(jīng)抗原刺激后IFN?γ分泌水平（n=6）Fig.7 IFN?γ secretion level of splenic lymphocytes stimulated by antigen（n=6）

3 討論

鮑曼不動桿菌作為一種革蘭氏陰性桿菌，滅活全菌疫苗自然成為最初的候選疫苗研究對象。研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌滅活全菌疫苗經(jīng)動物免疫接種后可誘導(dǎo)高水平的抗體應(yīng)答和較好的免疫保護效應(yīng)［10］，這種類型的疫苗具有將細菌的多種抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的優(yōu)點［11］。但隨后研究表明滅活全菌疫苗在制備過程中可能出現(xiàn)滅活不全或內(nèi)毒素殘留，機體免疫接種后可能引起嚴重的炎癥反應(yīng)，滅活全菌疫苗中的某些抗原蛋白可能誘導(dǎo)免疫耐受，而某些蛋白成分可能對人體組織細胞造成損害等缺點，滅活全菌疫苗并非鮑曼不動桿菌最理想的候選疫苗［12-13］?；蛑亟M亞單位疫苗具有抗原成分可控、重復(fù)性好、易于去除細菌內(nèi)毒素影響等優(yōu)點。因此，研制安全高效的鮑曼不動桿菌基因重組疫苗成為目前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。

SmpA被認為是革蘭陰性桿菌的重要毒力分子。研究表明［14］它是大腸桿菌中組裝外膜蛋白的YaeT復(fù)合物的組成部分，在傷寒桿菌屬E調(diào)節(jié)因子，其表達受遠近兩端啟動子的調(diào)控［15］。此外，smpA編碼的蛋白與銅綠假單胞菌的OmlA屬于同一家族［16］，盡管目前對鮑曼菌的SmpA功能尚未研究，但它在上述三類細菌中的功能均與維持細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性有關(guān)。NlpA是一種內(nèi)膜錨定脂蛋白，它參與細菌外膜囊泡（OMVs）的發(fā)生［17］，對蛋氨酸攝入發(fā)揮重要作用［18］。已有研究［19］報道了NlpA可作為鮑曼不動桿菌的候選抗原，開發(fā)疫苗來預(yù)防其感染。研究發(fā)現(xiàn)，基于單個抗原蛋白的重組亞單位疫苗的免疫保護效應(yīng)不理想，因而，目前更傾向于鮑曼不動桿菌多價亞單位疫苗研究。GUO等［20］構(gòu)建了OmpK/Omp22雙價融合亞單位疫苗，發(fā)現(xiàn)其動物免疫保護效應(yīng)明顯強于單價重組疫苗，但雙價疫苗的免疫保護效應(yīng)仍然不十分理想，仍需進一步篩選免疫優(yōu)勢抗原、尋找最佳的抗原組合，以便進一步增強其免疫原性和免疫保護性。因而，本研究選了SmpA和NlpA兩種抗原蛋白，將其與Omp22融合構(gòu)建三價融合亞單位疫苗，為了避免融合抗原分子量太大，給蛋白純化帶來不便，本研究只選擇了NlpA蛋白N末端128個氨基酸的肽段，為了盡可能保持抗原分子的天然構(gòu)象，在抗原蛋白相互融合部位添加了柔性連接子GGGGSGGGG。將純化到的SmpA/Omp22/NlpA（1?128）免疫小鼠后可誘導(dǎo)高滴度的抗原特異性IgG抗體。IL?4和IFN?γ作為細菌的關(guān)鍵細胞因子，參與了細菌感染的免疫防御［21］，本研究結(jié)果表明免疫小鼠脾淋巴細胞經(jīng)SmpA/Omp22/NlpA（1?128）融合蛋白刺激培養(yǎng)后所產(chǎn)生的IL?4水平明顯高于佐劑組和PBS對照組，而脾淋巴細胞體外刺激培養(yǎng)后IFN?γ產(chǎn)生水平各組間無顯著性差異，這表明該融合蛋白主要誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。

總之，本研究成功制備了鮑曼不動桿菌SmpA/Omp22/NlpA（1?128）融合蛋白，小鼠免疫接種后顯示出較強免疫原性，為進一步比較分析和評估其免疫保護性奠定了基礎(chǔ)。