孫曉東 朱波 柴森茂 陶艷麗 魯晶晶 徐紅霞 許倩倩 付攀 桑明

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北十堰442000）

新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）對(duì)人類來說是一種全新的疾病。研究發(fā)現(xiàn)“炎癥風(fēng)暴”可能是重癥和危重癥患者進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），以及發(fā)生膿毒性休克、代謝性酸中毒、凝血功能異常、多器官衰竭等危重癥狀的根本原因之一［1］。因此，盡快揭示嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS?CoV?2）（國(guó)際病毒分類委員會(huì)命名）的致病特性，及其誘發(fā)“炎癥風(fēng)暴”的免疫機(jī)制，是應(yīng)對(duì)SARS?CoV?2感染的根本策略。

炎性反應(yīng)參與機(jī)體多種生理病理過程，中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、血小板/淋巴細(xì)胞比值（platelet to lym?phocyte ratio，PLR）、淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比值（lym?phocyte to monocyte ratio，LMR）可做為炎性反應(yīng)的指標(biāo)。在腫瘤疾病、心腦血管疾病、感染性疾病中上述比值綜合體現(xiàn)患者體內(nèi)炎性反應(yīng)和免疫狀態(tài)，在疾病的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中有重要的參考價(jià)值［2-7］。既往研究顯示NLR與病毒感染患者的預(yù)后密切相關(guān)［8］，最近一項(xiàng)針對(duì)61例COVID?19患者的研究報(bào)告顯示，NLR是COVID?19重癥患者的早期識(shí)別因素，也是患者重癥化的重要指標(biāo)［9］。CD15又稱粒細(xì)胞相關(guān)性抗原，是成熟的中性粒細(xì)胞表面標(biāo)記抗原，CD15在中性粒細(xì)胞活化和非活化狀態(tài)下的表達(dá)強(qiáng)度不一，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)感染癥狀時(shí)CD15的表達(dá)強(qiáng)度可以發(fā)生變化［10］，而HLA?DR是T細(xì)胞被活化的表面抗原之一［11-12］。本研究納入20例COVID?19患者，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞中CD15的表達(dá)，T淋巴細(xì)胞HLA?DR的表達(dá)率，分析CD15+中性粒細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞與SARS?CoV?2感染患者病情進(jìn)展的相關(guān)性，探討NLR、CD15+中性粒細(xì)胞頻數(shù)、HLA?DR+T淋巴細(xì)胞的頻數(shù)在預(yù)測(cè)COVID?19患者的炎癥水平中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020年2-3月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院救治的SARS?coV?2感染患者20例，其中男15例，女5例，年齡范圍為28～76歲。所有患者均于收治當(dāng)日通過咽拭子采樣后送檢SARS?CoV?2核酸，并行胸部CT檢查，經(jīng)2次SARS?CoV?2核酸檢測(cè)均為陽性，10例在入院后病情進(jìn)展迅速，最終轉(zhuǎn)入ICU救治，納入重度組，男8例，女2例，年齡范圍為32～76歲；余10例病例，病情平穩(wěn)，納入普通組，男7例，女3例，年齡范圍為28～68歲。全部入組患者診斷符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第三版）》［13］。本研究已通過襄陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（2020GCP005），符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集收集患者入院當(dāng)天（基線）、1周后、出院時(shí)血常規(guī)中總白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)，血生化檢測(cè)中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（1actate dehydrogenase，LDH）、C反應(yīng)蛋白（C?reac?tive pmtein，CRP）等臨床指標(biāo)。計(jì)算NLR、ΔNLR1（入院后1周NLR）、ΔNLR2（出院），比較兩組間的差異。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)采用多色抗人單克隆抗體（mAbs）聯(lián)合試劑PerCP?cy5.5?CD45/PE?CD3/FITC?CD15/APC?HLA?DR和匹配的同型對(duì)照，在入院當(dāng)天、1周后、出院當(dāng)天測(cè)定外周血免疫細(xì)胞亞群。將EDTA抗凝外周血100 μL進(jìn)行抗體染色，用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞占比，CD15+中性粒細(xì)胞、HLA?DR+T細(xì)胞百分比。所有試劑均購自BD公司（BD，F(xiàn)ranklin Lakes，USA）。所有標(biāo)本均采用BD FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并使用BD流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布的計(jì)量資料應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料采用Mann?whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，用χ2檢驗(yàn)或確切概率法進(jìn)行比較。應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較兩組患者的基本資料顯示，在年齡、性別、并發(fā)癥等方面，兩組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。重度組患者有60%出現(xiàn)肌痛癥，與普通組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 兩組患者治療期間中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比及NLR 均發(fā)生動(dòng)態(tài)變化從三次檢測(cè)結(jié)果分析，兩組患者入院后中性粒細(xì)胞百分比均存在先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化，淋巴細(xì)胞百分比則是先降低后升高的動(dòng)態(tài)變化，入院時(shí)和入院一周后檢測(cè)結(jié)果在兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，出院時(shí)兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。入院時(shí)，重度組與普通組NLR比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療1周后，兩組間NLR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；出院時(shí)，兩組間NLR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組間ΔNLR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。重度組中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比及NLR在治療的第1周時(shí)達(dá)到高峰，這與患者轉(zhuǎn)入ICU治療的時(shí)間基本吻合，并在出院時(shí)恢復(fù)到與輕度患者相當(dāng)?shù)乃健?/p>

表1 兩組患者入院時(shí)基本信息Tab.1 Basic information of two groups at the time of admission 例（%）

表2 兩組患者治療期間NLR 及ΔNLR 比較Tab.2 Comparison of NLR and ΔNLR during treatment between two groups M（P25，P75）

2.3 兩組患者治療期間CD15+中性粒細(xì)胞與HLADR+T 細(xì)胞頻數(shù)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化流式檢測(cè)圈門策略見圖2，CD45標(biāo)記白細(xì)胞后，圈出淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞，粒細(xì)胞檢測(cè)FITC?CD15+的百分比。兩組患者治療1周時(shí)CD15+粒細(xì)胞的百分比有明顯差異，見圖2B；CD15+粒細(xì)胞的百分比在治療期間有動(dòng)態(tài)變化，兩組間有明顯差異（圖3A）。淋巴細(xì)胞檢測(cè)T細(xì)胞標(biāo)記CD3，然后檢測(cè)T細(xì)胞HLA?DR+的百分比，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2C、3B。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD15+中性粒細(xì)胞在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重度組CD15+中性粒細(xì)胞百分比有動(dòng)態(tài)變化，入院1周時(shí)達(dá)到高峰，隨治療好轉(zhuǎn)比例下降；普通組CD15+中性粒細(xì)胞百分比沒有明顯變化，見圖3A?；罨腡細(xì)胞水平在兩組都有明顯動(dòng)態(tài)變化，入院1周時(shí)升到高峰，隨治療好轉(zhuǎn)比例下降，重度組HLA?DR+T細(xì)胞變化波動(dòng)更大，見圖3B。

3 討論

SARS?CoV?2是目前已知的除SARS?CoV（引發(fā)重癥急性呼吸綜合征）［14］和MERS?CoV（引發(fā)中東呼吸綜合征）［15］外又一種高致病性冠狀病毒。由于免疫細(xì)胞對(duì)全身器官都有作用，患者死因也不僅是呼吸衰竭，許多死亡病例是死于心臟、腎臟、肝臟衰竭，而這些臟器受損的主要原因就是病毒誘發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴［1，16］。SARS和MERS病理性損傷的嚴(yán)重程度與肺部中性粒細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)和外周血中中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加有關(guān)［17-20］。因此，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加的幅度和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降的幅度也可能提示COVID?19患者炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，也表明了病毒感染對(duì)免疫系統(tǒng)的損害程度的擴(kuò)大。因此，NLR可能是反映COVID?19患者炎癥和免疫反應(yīng)不平衡程度的一個(gè)指標(biāo)。

圖1 中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in the percentage of neutrophils and lymphocytes

圖2 流式檢測(cè)外周血CD15+中性粒細(xì)胞和HLA?DR+T 細(xì)胞的頻數(shù)Fig.2 CD15+neutrophils and HLA?DR+T cells of peripheral blood were detected by FCM

圖3 流式檢測(cè)外周血CD15+中性粒細(xì)胞和HLA?DR+T 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Flow cytometric detection of CD15+neutrophils and HLA?DR+T cells in peripheral blood

作為人體血液循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞在先天免疫中對(duì)抵御入侵的病原體發(fā)揮重要的吞噬殺傷作用，但其過度浸潤(rùn)和激活可導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的破壞和更嚴(yán)重的炎癥。因此，中性粒細(xì)胞在炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要而雙重的角色。CD15是人中性粒細(xì)胞的表面標(biāo)志之一，在正常情況下，保持靜止?fàn)顟B(tài)的中性粒細(xì)胞大約以1 000 mm/s的速度在血液中高速循環(huán)流動(dòng)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生病原體入侵時(shí)，中性粒細(xì)胞通過識(shí)別和結(jié)合炎癥部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的選擇素和黏附分子，被招募到炎癥部位，進(jìn)而通過吞噬、脫顆粒以及形成中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)（neutrophil extra?cellular traps，NET）的方式對(duì)病原體進(jìn)行清除［21］。最新研究顯示，人類嗜中性粒細(xì)胞中NET的形成與肺炎患者呼吸窘迫的發(fā)生率和嚴(yán)重程度相關(guān)［22］。中性粒細(xì)胞對(duì)炎癥部位進(jìn)行吞噬殺傷的同時(shí)，分泌各種趨化因子，招募其他免疫細(xì)胞進(jìn)入感染部位，進(jìn)一步觸發(fā)炎癥信號(hào)［10］。T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫在機(jī)體清除和殺傷病毒的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［23］。T細(xì)胞活化時(shí)，在其細(xì)胞表面的分子標(biāo)志物中，HLA?DR分子與CD38分子參與激活信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］，通過誘導(dǎo)特定的細(xì)胞因子生成來促進(jìn)T細(xì)胞的活化。因此，中性粒細(xì)胞CD15的表達(dá)比例和T細(xì)胞HLA?DR的表達(dá)比例可以反應(yīng)機(jī)體炎癥反應(yīng)的狀態(tài)。

本研究對(duì)20例COVID?19患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)兩組患者NLR均隨病情進(jìn)展動(dòng)態(tài)變化，治療1周時(shí)，NLR顯著升高，治愈出院時(shí)，顯著降低；重度患者比普通組患者變化更加顯著；HLA?DR+T細(xì)胞和CD15+中性粒細(xì)胞比例在重度組中明顯高于普通組。中性粒細(xì)胞活化后釋放趨化因子可激活T細(xì)胞，活化的T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IFN?γ、IL?2、IL?4、IL?10、TNF?α等，中性粒細(xì)胞被過度活化和增殖，形成細(xì)胞炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這可能是炎性風(fēng)暴形成的機(jī)制之一。

LIU等［24］篩選了影響COVID?19患者預(yù)后的因素，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞顯著減少，而且中性粒細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞的比值（N8R）在ROC曲線分析中表現(xiàn)更好，AUC值高于NLR，在預(yù)測(cè)COVID?19患者病情嚴(yán)重化方面，N8R可能是比NLR更有力的因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLR存在動(dòng)態(tài)變化，但是ΔNLR在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量少、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)少有關(guān)。

綜上所述，外周血中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，尤其是CD15+中性粒細(xì)胞和HLA?DR+T細(xì)胞的數(shù)量與疾病的嚴(yán)重程度是動(dòng)態(tài)相關(guān)的。這與WANG等［25］描述COVID?19患者淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化的研究是一致的。NLR是早期鑒測(cè)COVID?19重癥病例的有力預(yù)后因素。這項(xiàng)工作有助于闡釋SARS?CoV?2感染的免疫逃逸機(jī)制。