孫曉東 朱波 柴森茂 陶艷麗 魯晶晶 徐紅霞 許倩倩 付攀 桑明

湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，武當特色中藥研究湖北省重點實驗室（湖北十堰442000）

新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）對人類來說是一種全新的疾病。研究發(fā)現(xiàn)“炎癥風暴”可能是重癥和危重癥患者進展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），以及發(fā)生膿毒性休克、代謝性酸中毒、凝血功能異常、多器官衰竭等危重癥狀的根本原因之一［1］。因此，盡快揭示嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS?CoV?2）（國際病毒分類委員會命名）的致病特性，及其誘發(fā)“炎癥風暴”的免疫機制，是應對SARS?CoV?2感染的根本策略。

炎性反應參與機體多種生理病理過程，中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、血小板/淋巴細胞比值（platelet to lym?phocyte ratio，PLR）、淋巴細胞/單核細胞比值（lym?phocyte to monocyte ratio，LMR）可做為炎性反應的指標。在腫瘤疾病、心腦血管疾病、感染性疾病中上述比值綜合體現(xiàn)患者體內(nèi)炎性反應和免疫狀態(tài)，在疾病的診斷、治療和預后評估中有重要的參考價值［2-7］。既往研究顯示NLR與病毒感染患者的預后密切相關(guān)［8］，最近一項針對61例COVID?19患者的研究報告顯示，NLR是COVID?19重癥患者的早期識別因素，也是患者重癥化的重要指標［9］。CD15又稱粒細胞相關(guān)性抗原，是成熟的中性粒細胞表面標記抗原，CD15在中性粒細胞活化和非活化狀態(tài)下的表達強度不一，當機體出現(xiàn)感染癥狀時CD15的表達強度可以發(fā)生變化［10］，而HLA?DR是T細胞被活化的表面抗原之一［11-12］。本研究納入20例COVID?19患者，采用流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞中CD15的表達，T淋巴細胞HLA?DR的表達率，分析CD15+中性粒細胞和活化的T淋巴細胞與SARS?CoV?2感染患者病情進展的相關(guān)性，探討NLR、CD15+中性粒細胞頻數(shù)、HLA?DR+T淋巴細胞的頻數(shù)在預測COVID?19患者的炎癥水平中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020年2-3月湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院救治的SARS?coV?2感染患者20例，其中男15例，女5例，年齡范圍為28～76歲。所有患者均于收治當日通過咽拭子采樣后送檢SARS?CoV?2核酸，并行胸部CT檢查，經(jīng)2次SARS?CoV?2核酸檢測均為陽性，10例在入院后病情進展迅速，最終轉(zhuǎn)入ICU救治，納入重度組，男8例，女2例，年齡范圍為32～76歲；余10例病例，病情平穩(wěn)，納入普通組，男7例，女3例，年齡范圍為28～68歲。全部入組患者診斷符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第三版）》［13］。本研究已通過襄陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（2020GCP005），符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集收集患者入院當天（基線）、1周后、出院時血常規(guī)中總白細胞數(shù)、淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、血小板計數(shù)，血生化檢測中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（1actate dehydrogenase，LDH）、C反應蛋白（C?reac?tive pmtein，CRP）等臨床指標。計算NLR、ΔNLR1（入院后1周NLR）、ΔNLR2（出院），比較兩組間的差異。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測采用多色抗人單克隆抗體（mAbs）聯(lián)合試劑PerCP?cy5.5?CD45/PE?CD3/FITC?CD15/APC?HLA?DR和匹配的同型對照，在入院當天、1周后、出院當天測定外周血免疫細胞亞群。將EDTA抗凝外周血100 μL進行抗體染色，用紅細胞裂解液除去紅細胞，流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞、中性粒細胞占比，CD15+中性粒細胞、HLA?DR+T細胞百分比。所有試劑均購自BD公司（BD，F(xiàn)ranklin Lakes，USA）。所有標本均采用BD FACS Aria Ⅱ流式細胞儀進行檢測，并使用BD流式細胞儀Diva軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法連續(xù)變量用均數(shù)±標準差表示，正態(tài)分布的計量資料應用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布的計數(shù)資料采用Mann?whitney U檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，用χ2檢驗或確切概率法進行比較。應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較兩組患者的基本資料顯示，在年齡、性別、并發(fā)癥等方面，兩組之間差異沒有統(tǒng)計學差異。重度組患者有60%出現(xiàn)肌痛癥，與普通組相比差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 兩組患者治療期間中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比及NLR 均發(fā)生動態(tài)變化從三次檢測結(jié)果分析，兩組患者入院后中性粒細胞百分比均存在先升高后降低的動態(tài)變化，淋巴細胞百分比則是先降低后升高的動態(tài)變化，入院時和入院一周后檢測結(jié)果在兩組間差異均有統(tǒng)計學意義，出院時兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義，見圖1。入院時，重度組與普通組NLR比較差異有統(tǒng)計學意義；治療1周后，兩組間NLR差異有統(tǒng)計學意義；出院時，兩組間NLR差異有統(tǒng)計學意義。兩組間ΔNLR差異無統(tǒng)計學意義。見表2。重度組中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比及NLR在治療的第1周時達到高峰，這與患者轉(zhuǎn)入ICU治療的時間基本吻合，并在出院時恢復到與輕度患者相當?shù)乃健?/p>

表1 兩組患者入院時基本信息Tab.1 Basic information of two groups at the time of admission 例（%）

表2 兩組患者治療期間NLR 及ΔNLR 比較Tab.2 Comparison of NLR and ΔNLR during treatment between two groups M（P25，P75）

2.3 兩組患者治療期間CD15+中性粒細胞與HLADR+T 細胞頻數(shù)發(fā)生動態(tài)變化流式檢測圈門策略見圖2，CD45標記白細胞后，圈出淋巴細胞、單核細胞、粒細胞，粒細胞檢測FITC?CD15+的百分比。兩組患者治療1周時CD15+粒細胞的百分比有明顯差異，見圖2B；CD15+粒細胞的百分比在治療期間有動態(tài)變化，兩組間有明顯差異（圖3A）。淋巴細胞檢測T細胞標記CD3，然后檢測T細胞HLA?DR+的百分比，兩組間差異有統(tǒng)計學意義，見圖2C、3B。流式檢測發(fā)現(xiàn)CD15+中性粒細胞在兩組間差異有統(tǒng)計學意義，重度組CD15+中性粒細胞百分比有動態(tài)變化，入院1周時達到高峰，隨治療好轉(zhuǎn)比例下降；普通組CD15+中性粒細胞百分比沒有明顯變化，見圖3A。活化的T細胞水平在兩組都有明顯動態(tài)變化，入院1周時升到高峰，隨治療好轉(zhuǎn)比例下降，重度組HLA?DR+T細胞變化波動更大，見圖3B。

3 討論

SARS?CoV?2是目前已知的除SARS?CoV（引發(fā)重癥急性呼吸綜合征）［14］和MERS?CoV（引發(fā)中東呼吸綜合征）［15］外又一種高致病性冠狀病毒。由于免疫細胞對全身器官都有作用，患者死因也不僅是呼吸衰竭，許多死亡病例是死于心臟、腎臟、肝臟衰竭，而這些臟器受損的主要原因就是病毒誘發(fā)的細胞因子風暴［1，16］。SARS和MERS病理性損傷的嚴重程度與肺部中性粒細胞的廣泛浸潤和外周血中中性粒細胞數(shù)量的增加有關(guān)［17-20］。因此，中性粒細胞計數(shù)增加的幅度和淋巴細胞計數(shù)下降的幅度也可能提示COVID?19患者炎癥反應的強度，也表明了病毒感染對免疫系統(tǒng)的損害程度的擴大。因此，NLR可能是反映COVID?19患者炎癥和免疫反應不平衡程度的一個指標。

圖1 中性粒細胞和淋巴細胞百分比動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in the percentage of neutrophils and lymphocytes

圖2 流式檢測外周血CD15+中性粒細胞和HLA?DR+T 細胞的頻數(shù)Fig.2 CD15+neutrophils and HLA?DR+T cells of peripheral blood were detected by FCM

圖3 流式檢測外周血CD15+中性粒細胞和HLA?DR+T 細胞的動態(tài)變化Fig.3 Flow cytometric detection of CD15+neutrophils and HLA?DR+T cells in peripheral blood

作為人體血液循環(huán)中最豐富的白細胞，中性粒細胞在先天免疫中對抵御入侵的病原體發(fā)揮重要的吞噬殺傷作用，但其過度浸潤和激活可導致組織結(jié)構(gòu)的破壞和更嚴重的炎癥。因此，中性粒細胞在炎癥反應過程中扮演著重要而雙重的角色。CD15是人中性粒細胞的表面標志之一，在正常情況下，保持靜止狀態(tài)的中性粒細胞大約以1 000 mm/s的速度在血液中高速循環(huán)流動。當機體發(fā)生病原體入侵時，中性粒細胞通過識別和結(jié)合炎癥部位的血管內(nèi)皮細胞表面表達的選擇素和黏附分子，被招募到炎癥部位，進而通過吞噬、脫顆粒以及形成中性粒細胞誘捕網(wǎng)（neutrophil extra?cellular traps，NET）的方式對病原體進行清除［21］。最新研究顯示，人類嗜中性粒細胞中NET的形成與肺炎患者呼吸窘迫的發(fā)生率和嚴重程度相關(guān)［22］。中性粒細胞對炎癥部位進行吞噬殺傷的同時，分泌各種趨化因子，招募其他免疫細胞進入感染部位，進一步觸發(fā)炎癥信號［10］。T細胞介導的特異性細胞免疫在機體清除和殺傷病毒的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［23］。T細胞活化時，在其細胞表面的分子標志物中，HLA?DR分子與CD38分子參與激活信號的轉(zhuǎn)導［11］，通過誘導特定的細胞因子生成來促進T細胞的活化。因此，中性粒細胞CD15的表達比例和T細胞HLA?DR的表達比例可以反應機體炎癥反應的狀態(tài)。

本研究對20例COVID?19患者進行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)兩組患者NLR均隨病情進展動態(tài)變化，治療1周時，NLR顯著升高，治愈出院時，顯著降低；重度患者比普通組患者變化更加顯著；HLA?DR+T細胞和CD15+中性粒細胞比例在重度組中明顯高于普通組。中性粒細胞活化后釋放趨化因子可激活T細胞，活化的T細胞釋放細胞因子IFN?γ、IL?2、IL?4、IL?10、TNF?α等，中性粒細胞被過度活化和增殖，形成細胞炎癥信號級聯(lián)反應，這可能是炎性風暴形成的機制之一。

LIU等［24］篩選了影響COVID?19患者預后的因素，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞顯著減少，而且中性粒細胞與CD8+ T細胞的比值（N8R）在ROC曲線分析中表現(xiàn)更好，AUC值高于NLR，在預測COVID?19患者病情嚴重化方面，N8R可能是比NLR更有力的因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLR存在動態(tài)變化，但是ΔNLR在兩組間差異無統(tǒng)計學意義，可能與樣本量少、動態(tài)監(jiān)測時間點少有關(guān)。

綜上所述，外周血中性粒細胞和淋巴細胞的數(shù)量，尤其是CD15+中性粒細胞和HLA?DR+T細胞的數(shù)量與疾病的嚴重程度是動態(tài)相關(guān)的。這與WANG等［25］描述COVID?19患者淋巴細胞亞群和細胞因子動態(tài)變化的研究是一致的。NLR是早期鑒測COVID?19重癥病例的有力預后因素。這項工作有助于闡釋SARS?CoV?2感染的免疫逃逸機制。