李擎天，郭曉奎

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系， 上海 200025； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院全球健康學(xué)院， 上海 200025

以細(xì)菌為代表的原核生物，在地球上的存在可追溯到30多億年前。以細(xì)菌為感染對(duì)象的噬菌體是最早的病毒形態(tài)，其歷史被認(rèn)為同在30億年以上[1]。在地球生物圈里，大約有超過1031個(gè)噬菌體顆粒，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)平均約有10個(gè)噬菌體[2]。人體細(xì)胞、噬菌體、細(xì)菌及其他微生物共同組成了人體內(nèi)環(huán)境。因此，噬菌體與細(xì)菌的相互作用也持續(xù)影響著人體健康。

噬菌體自1915年被描述、1940年被電鏡觀察到開始，一直被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染的重要候選制劑。同時(shí)，研究噬菌體所獲的成果在生命科學(xué)的多項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要的支撐作用，如DNA為遺傳物質(zhì)的論證、基因組測(cè)序、噬菌體展示技術(shù)等[3]。21世紀(jì)以來，由于細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥情況不斷加劇，傳統(tǒng)抗生素之外的抗菌制劑研究受到越來越多的關(guān)注。噬菌體可隨細(xì)菌分裂增殖，也可完全裂解細(xì)菌。與此同時(shí)，細(xì)菌也通過基因和表型的改變形成對(duì)抗噬菌體的機(jī)制，噬菌體針對(duì)細(xì)菌的對(duì)抗機(jī)制又形成自己的“抗細(xì)菌抗噬菌體機(jī)制”，循環(huán)往復(fù)，綿延不絕。本文從阻止噬菌體吸附、超感染排除(superinfection exclusion，Sie)、限制性修飾(restriction modification，RM)系統(tǒng)、CRISPR-Cas、流產(chǎn)感染(abortive infection，Abi)等方面對(duì)細(xì)菌抗噬菌體的機(jī)制以及噬菌體針對(duì)細(xì)菌抗性機(jī)制的應(yīng)變進(jìn)行綜述，期望能為細(xì)菌耐藥性及抗菌制劑的研究提供參考。

1 細(xì)菌抗噬菌體的機(jī)制

細(xì)菌抗噬菌體的機(jī)制涉及噬菌體的感染、增殖、裂解過程(即噬菌體的生活周期)。主要機(jī)制為阻止噬菌體吸附、阻止噬菌體 DNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、降解噬菌體的核酸、干擾噬菌體生活周期及阻止噬菌體顆粒釋放、干擾噬菌體的組裝等。

1.1 阻止噬菌體吸附

噬菌體感染宿主的第一步是對(duì)宿主的吸附。一些細(xì)菌(如銅綠假單胞菌)通過阻止噬菌體吸附來對(duì)抗其感染(圖1a)[4]。細(xì)菌阻止噬菌體吸附的情況包括：①革蘭陰性細(xì)菌分泌外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)，其含有可充當(dāng)噬菌體受體的外膜蛋白，競(jìng)爭(zhēng)性隔離細(xì)胞外噬菌體顆粒；②噬菌體受體(如銅綠假單胞菌Ⅵ型菌毛)糖基化而隱藏，使噬菌體無法識(shí)別；③噬菌體受體被表面結(jié)構(gòu)(如多糖莢膜)屏蔽而無法被噬菌體吸附；④噬菌體自身編碼蛋白與其受體結(jié)合，阻止同類型噬菌體與細(xì)菌受體結(jié)合；⑤噬菌體受體基因突變使噬菌體不能結(jié)合；⑥噬菌體受體基因不表達(dá)，導(dǎo)致相應(yīng)噬菌體無法感染。

圖1 細(xì)菌抗噬菌體的主要機(jī)制

1.2 Sie——阻止噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)

Sie源自一種蛋白，它可阻止噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而賦予后者針對(duì)特定噬菌體的免疫力(圖1b)。 這些蛋白多為膜錨定蛋白或與膜成分相關(guān)。編碼這些蛋白質(zhì)的基因通常存在于噬菌體中，因此Sie在噬菌體-噬菌體相互作用而非噬菌體-宿主相互作用中發(fā)揮重要作用。

以大腸埃希菌T4噬菌體為例，T4噬菌體具有2個(gè)Sie系統(tǒng)，分別由imm和sp編碼。正常情況下，T4噬菌體感染大腸埃希菌時(shí)，細(xì)菌的肽聚糖層被其gp5編碼的溶菌酶降解，內(nèi)膜蛋白易位，DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。Sie的情況包括：①已進(jìn)入裂解周期的T4噬菌體編碼Imm蛋白，與另一種膜蛋白結(jié)合并改變注入部位的構(gòu)象，阻斷其他T4樣噬菌體的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；②T4噬菌體編碼的Sp蛋白通過抑制噬菌體gp5編碼的溶菌酶活性而阻止肽聚糖降解，使DNA停留在肽聚糖層與外膜之間[5]。

1.3 RM系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng)——降解噬菌體的核酸

RM系統(tǒng)是一種普遍存在且極其多樣化的抗噬菌體防御模式。 它們通常由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶組成。限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別短的DNA序列并切割噬菌體DNA。這些序列既存在于細(xì)菌宿主中，也存在于入侵的噬菌體中，宿主使用甲基轉(zhuǎn)移酶修飾自己的DNA來避免其被限制性酶識(shí)別，從而保護(hù)自身基因組。入侵的噬菌體通常不會(huì)被甲基化，因此在侵入時(shí)會(huì)被切割。RM 系統(tǒng)根據(jù)其作用機(jī)制和亞基組成分為4型。

以Ⅰ型 RM 系統(tǒng)為例(圖1c)，Ⅰ型RM系統(tǒng)的組分為雜合寡聚復(fù)合物，通常包含2個(gè)DNA裂解所需的核酸酶亞基(R)，以及1個(gè)指定識(shí)別DNA序列的特異性亞基和2個(gè)催化甲基化反應(yīng)的甲基轉(zhuǎn)移酶亞基(M)。這些酶識(shí)別其特定靶序列的甲基化狀態(tài)。完全甲基化的DNA被認(rèn)為是細(xì)菌基因組的一部分。半甲基化的DNA被識(shí)別為新復(fù)制的細(xì)菌DNA，甲基轉(zhuǎn)移酶(M)會(huì)在輔因子的幫助下進(jìn)一步甲基化修飾另一條鏈。入侵的噬菌體DNA通常缺乏特異性修飾，因此會(huì)被核酸酶(R)識(shí)別為外源DNA并被切割[6]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是目前廣泛使用的基因編輯技術(shù)的最初來源(圖1d)。噬菌體初次入侵時(shí)，Cas1-Cas2 復(fù)合體選擇一部分外源DNA(原間隔序列)整合到宿主的CRISPR陣列中，成為間隔序列。間隔序列隨后被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的pre-crRNA，并被Cas蛋白或細(xì)胞RNase進(jìn)一步加工為成熟的crRNA。當(dāng)具有相同或非常相似的原間隔序列的噬菌體感染時(shí)，成熟的crRNA與Cas核酸酶組合成效應(yīng)復(fù)合體，識(shí)別緊隨原間隔序列后的PAM序列，然后Cas蛋白對(duì)與crRNA互補(bǔ)的入侵dsDNA進(jìn)行切割[7]。

1.4 Abi系統(tǒng)和毒素-抗毒素系統(tǒng)——干擾噬菌體生活周期并阻止噬菌體顆粒釋放

Abi系統(tǒng)是細(xì)菌細(xì)胞為阻止噬菌體釋放而自我犧牲的過程。它是一種“程序性細(xì)胞死亡”，是通過干擾細(xì)胞DNA生物合成的基本過程(如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)或誘導(dǎo)膜滲漏來實(shí)現(xiàn)的(圖1e)。以表皮葡萄球菌Stk2 Abi系統(tǒng)為例，在溶原性噬菌體進(jìn)入裂解周期后，其表達(dá)的蛋白PacK會(huì)觸發(fā)表皮葡萄球菌絲氨酸/蘇氨酸激酶Stk2磷酸化。后者進(jìn)而引起一系列涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制和代謝的細(xì)胞因子磷酸化。這種廣泛的磷酸化可能會(huì)破壞細(xì)菌基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯途徑，最終導(dǎo)致噬菌體感染周期的流產(chǎn)和細(xì)胞死亡[8]。

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)(圖1f)廣泛存在于細(xì)菌、古細(xì)菌的染色體、質(zhì)粒、噬菌體的基因組上，依靠一個(gè)毒素和一個(gè)對(duì)毒素有拮抗作用的抗毒素組成的二元系統(tǒng)行使防御功能。TA系統(tǒng)的基本特征是抗毒素的不穩(wěn)定性，必須連續(xù)表達(dá)才能與毒素保持適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量比并中和毒素。TA系統(tǒng)中的毒素可作用于中心法則的多個(gè)過程，最終導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)停滯或休眠。因此， TA系統(tǒng)既可以作為休眠誘導(dǎo)系統(tǒng)也可以作為Abi系統(tǒng)，其結(jié)果取決于一系列因素，包括毒素的作用機(jī)制、毒素活性的持續(xù)時(shí)間及噬菌體的生命周期。以植物病原體黑脛病菌的質(zhì)粒編碼的Ⅲ型TA系統(tǒng)為例，毒素ToxN為內(nèi)切RNase，抗毒素ToxI為RNA，毒素、抗毒素形成動(dòng)態(tài)平衡。噬菌體感染可通過抑制ToxIN轉(zhuǎn)錄、防止ToxI折疊和破壞ToxI-ToxN結(jié)合而抑制抗毒素能力，最終導(dǎo)致游離ToxN釋放。大量ToxN降解細(xì)胞RNA，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞及噬菌體死亡[9]。

1.5 干擾噬菌體組裝

噬菌體誘導(dǎo)性染色體島(phage-inducible chromosomal islands，PICI)廣泛存在于革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌中，是高度可移動(dòng)的遺傳元件家族，對(duì)基因水平轉(zhuǎn)移、宿主適應(yīng)性和毒力產(chǎn)生具有重要貢獻(xiàn)(圖1g)[10]。

以金黃色葡萄球菌致病島(Staphylococcusaureuspathogenic island，SaPI)為例。在無輔助噬菌體裂解生長(zhǎng)情況下，PICI的表達(dá)被PICI抑制子抑制而處于一種靜止的前噬菌體狀態(tài)。在輔助噬菌體處于裂解生長(zhǎng)周期時(shí)，早期會(huì)表達(dá)一種去阻遏蛋白，導(dǎo)致PICI從宿主染色體上切除，其基因組得以復(fù)制并表達(dá)。PICI的表達(dá)產(chǎn)物可通過不同機(jī)制干擾輔助噬菌體的組裝，如抑制輔助噬菌體晚期基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)輔助噬菌體衣殼的裝配，使其產(chǎn)生只能與較小的SaPI基因組包裝在一起的衣殼。最終導(dǎo)致PICI基因組被優(yōu)先包裝并防止形成輔助噬菌體顆粒。與革蘭陽性細(xì)菌不同，革蘭陰性細(xì)菌的PICI由PICI編碼的激活劑誘導(dǎo)，但激活劑的表達(dá)需要輔助噬菌體[10-11]。

2 噬菌體針對(duì)細(xì)菌抗性的應(yīng)變

在細(xì)菌產(chǎn)生針對(duì)噬菌體抗性機(jī)制的同時(shí)，噬菌體也相應(yīng)發(fā)生一系列改變。目前發(fā)現(xiàn)噬菌體針對(duì)細(xì)菌抗性的改變有：適應(yīng)新受體、應(yīng)對(duì)RM系統(tǒng)、應(yīng)對(duì)Abi系統(tǒng)、應(yīng)對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)以及溶原決策機(jī)制等。

2.1 適應(yīng)新受體

細(xì)菌通過改變噬菌體結(jié)合受體來抵御噬菌體的結(jié)合，噬菌體也可做出針對(duì)性的改變，從而結(jié)合新的受體(圖2a)。噬菌體依賴其尾部的受體結(jié)合蛋白(receptor binding protein，RBP)識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞膜上受體以完成吸附。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜上受體改變時(shí)，噬菌體尾部RBP也發(fā)生相應(yīng)改變，識(shí)別并結(jié)合新受體，再次吸附；當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜外形成包膜而掩蓋受體時(shí)，噬菌體產(chǎn)生水解酶降解包膜，使受體暴露從而再次吸附。細(xì)菌在不同時(shí)期、不同條件下可隨機(jī)表達(dá)受體，相應(yīng)地，噬菌體可修飾尾部受體結(jié)合蛋白，與不同時(shí)期和條件下表達(dá)的受體結(jié)合，以提高感染率[12]。

圖2 噬菌體針對(duì)細(xì)菌抗性的應(yīng)變

2.2 應(yīng)對(duì)RM系統(tǒng)

細(xì)菌產(chǎn)生RM系統(tǒng)來降解噬菌體的核酸，噬菌體則通過減少限制性位點(diǎn)以及抑制修飾酶等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌降解作用的逃避(圖2b)。一些噬菌體的基因中只有少量限制位點(diǎn)，或者相距太遠(yuǎn)而不被宿主的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別；部分噬菌體則通過宿主或自身對(duì)基因進(jìn)行甲基化，此時(shí)新合成的DNA將受到保護(hù)；噬菌體P1的DarA和DarB蛋白可結(jié)合到噬菌體DNA上遮蓋住限制位點(diǎn)，使限制性核酸內(nèi)切酶無法識(shí)別到位點(diǎn)；噬菌體T7的Ocr蛋白模仿靶DNA并隔離限制酶與甲基化酶和限制性核酸內(nèi)切酶結(jié)合而抑制其活性[13]；噬菌體λ的Ral蛋白激活甲基化酶活性并促進(jìn)對(duì)噬菌體DNA的保護(hù)[14]；某些噬菌體能編碼水解酶，水解限制性核酸內(nèi)切酶的輔因子從而抑制后者活性。

2.3 應(yīng)對(duì)Abi和TA系統(tǒng)

一些被感染的細(xì)菌通過“Abi”，以犧牲自我的方式限制噬菌體對(duì)鄰近細(xì)菌的感染，噬菌體則可以通過基因突變繞過Abi(圖2c)。例如，乳球菌屬某些噬菌體參與核苷酸代謝的基因發(fā)生突變，使得作用于代謝過程的磷酸化細(xì)胞因子失去活性，從而繞過Abi系統(tǒng)；噬菌體可編碼在功能上替代細(xì)菌抗毒素的分子，抵消毒素活性；噬菌體φTE產(chǎn)生假抗毒素RNA或劫持天然抗毒素ToxI，以在噬菌體感染期間中和毒素ToxN[15]，游離的ToxN減少將抑制Abi過程。

2.4 應(yīng)對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)

細(xì)菌可通過CRISPR-Cas系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體DNA的降解，而噬菌體則針對(duì)這一機(jī)制的一些關(guān)鍵點(diǎn)(如前間隔序列突變)，抑制CRISPR-Cas效應(yīng)復(fù)合物形成，從而保護(hù)自己免受殺滅(圖2d)[14]。例如，噬菌體原間隔序列或PAM序列突變，使得crRNA和靶DNA無法配對(duì)，起到干擾CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用；銅綠假單胞菌的溶原性噬菌體能編碼抑制CRISPR-Cas復(fù)合物形成或抑制其活性的蛋白質(zhì)，進(jìn)而抑制CRISPR-Cas系統(tǒng)[16]?；魜y[11]弧菌中，噬菌體基因組進(jìn)入細(xì)胞后表達(dá)病毒源性的crRNA和CRISPR-Cas復(fù)合物，以霍亂弧菌的PICI樣因子(PICI-like elements，PLE)為靶點(diǎn)，噬菌體CRISPR基因座與PLE序列互補(bǔ)，能特異地使CRISPR-Cas系統(tǒng)失活[17]。

2.5 溶原決策機(jī)制

噬菌體在感染宿主菌后是否進(jìn)入溶原周期將受到許多因素的影響[18]。如圖3所示，①當(dāng)多個(gè)噬菌體感染單個(gè)宿主菌時(shí)，所有感染的噬菌體溶原性的一致 “投票(vote)”對(duì)最終建立溶原性十分必要(圖3a)[19]；②前噬菌體可為細(xì)菌的基因開關(guān)。噬菌體與細(xì)菌基因組融合，從而使后者失活；而當(dāng)需要噬菌體基因時(shí)，便從細(xì)菌基因組中切除，重組為功能基因(圖3b)[21]；③噬菌體阻遏基因(repressor，rep)對(duì)溶原態(tài)的建立有重要意義。噬菌體整合前，rep包含一個(gè)水解標(biāo)記致使阻遏蛋白水解，促進(jìn)裂解；噬菌體整合后，水解標(biāo)記分離，阻遏蛋白穩(wěn)定表達(dá)，維持溶原態(tài)(圖3c)；④噬菌體感染宿主可釋放arbitrium肽，胞外arbitrium肽濃度不斷上升，導(dǎo)致噬菌體溶原態(tài)(圖3d)[20]。

圖3 溶原決策機(jī)制

3 結(jié)語

噬菌體的研究為生命科學(xué)尤其是基于基因組測(cè)序的宏基因組研究奠定了重要基礎(chǔ)。噬菌體與細(xì)菌的相互作用與它們的共同宿主——人體的健康息息相關(guān)。充分利用組學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步探究噬菌體這一古老個(gè)體的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、功能等特點(diǎn)，不僅可為應(yīng)對(duì)抗生素耐藥細(xì)菌感染提供有力支持，還有望在噬菌體與細(xì)菌相互作用的人工干預(yù)、助力生物制品研制和生產(chǎn)進(jìn)程等方面為促進(jìn)人類健康開辟新的路徑。