宋武慧，易志剛

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系， 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室， 上海 200032

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)屬于黃病毒科，其基因組為單股正鏈線性RNA[1]。人體被HCV感染后可罹患慢性肝炎和肝硬化，最終發(fā)展成肝細(xì)胞肝癌，甚至死亡[2]。目前的研究認(rèn)為，HCV編碼的蛋白前體經(jīng)宿主細(xì)胞及病毒自身的蛋白酶切割后，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒翻譯復(fù)制過程[3]。支持HCV高水平復(fù)制的細(xì)胞株只有Huh 7.5，它是由α-干擾素(IFN-α)以100 IU/ml的濃度處理HCV 復(fù)制子細(xì)胞后獲得。研究人員發(fā)現(xiàn)該HCV cured細(xì)胞支持HCV高水平復(fù)制，但并非所有HCV cured細(xì)胞株皆有對病毒易感的新特征[4]。雖然對HCV的探索已有突破性進(jìn)展，但病毒翻譯復(fù)制等關(guān)鍵生活周期環(huán)節(jié)并未徹底研究清楚。細(xì)胞模型的缺乏制約了對HCV生活周期進(jìn)行深入研究，因此構(gòu)建支持病毒高水平復(fù)制的細(xì)胞模型將為深入開展HCV基礎(chǔ)性科學(xué)研究提供有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞系Huh 7為本室保存[5]。肝癌細(xì)胞系Huh 7.5和HCV全長基因組質(zhì)粒Jc1G為美國洛克菲勒大學(xué)Charles Rice 教授饋贈[6]。HCV亞基因組sg-Jc1為本室人員在Jc1G基礎(chǔ)上構(gòu)建[5]。試劑：DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基(美國Corning Cellgro公司,10-013-CVa)，胎牛血清(以色列Biological Industries公司, 04-001-1ACS)，殺稻瘟菌素(美國Invitrogen公司，R21001)，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司，AM1334)，海腎熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega 公司, E2820)，IFN-γ(美國Proteintech公司, HZ-1301)，IFN-α(美國PBLassay science公司, 11200-2)， ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國PerkinElmer公司, NEL103E001EA)，TRIzolTMReagent (美國Invitrogen 公司, 15596018)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司，DRR047A)，熒光定量PCR試劑盒 (日本Takara公司，DRR041A)。實驗中所用抗體及來源如下：NS3抗體(美國Virogen公司; 217-A)，HRP羊抗鼠二抗 (美國Santa Cruz公司; sc-2005)，β-actin抗體 (美國Sigma公司; A1978)， MDA5 抗體 (美國CST公司; 5321S)， RIG-I 抗體 (美國Enzo Life Sciences 公司; Alme1)，MAVS 抗體(美國Santa Cruz 公司；sc-166583)。

1.2 方法

1.2.1 HCV復(fù)制子細(xì)胞株的建立 將HCV 亞基因組sg-Jc1酶切線性化后體外轉(zhuǎn)錄的RNA電轉(zhuǎn)入Huh 7細(xì)胞，3 d后換含有5 μg/mL的殺稻瘟菌素(blasticidin)培養(yǎng)液置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。此后每隔2 d換液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞單克隆出現(xiàn)。取5～6個克隆，分別種于96孔板中繼續(xù)置37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)液中blasticidin的濃度調(diào)節(jié)為0.5 μg/mL。待細(xì)胞在板上長滿后，轉(zhuǎn)至更大孔徑培養(yǎng)板中, 長滿后再轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，傳代擴增細(xì)胞并凍存于液氮罐。

1.2.2 HCV cured細(xì)胞株的建立 將HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞株以5×104細(xì)胞/mL鋪于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)過夜。次日更換含有 1 000 IU/瓶 IFN-γ的新鮮培養(yǎng)基，每隔2 d換液1次，待培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代，培養(yǎng)3周。3周后撤去IFN，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1周后，取細(xì)胞樣本檢測病毒RNA，陰性細(xì)胞進(jìn)行傳代擴增并凍存于液氮罐。

1.2.3 病毒感染 將細(xì)胞以5×104孔鋪板于48孔板，待細(xì)胞匯合度為30%～40%時加入病毒Jc1-G[感染復(fù)數(shù) (multiplicity of infection, MOI) 為0.1]。感染后6 h用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗3遍，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞。

1.2.4 熒光素酶活性檢測 開啟熒光檢測儀GloMax? 20/20 Luminometer(美國Promega公司)，將機器參數(shù)設(shè)置為Read 10 s; delay 2 s。取上清液10 μL，加入10 μL 2×passive lysis buffer混勻后加入50 μL 1× renilla luciferase substrate，吹吸5次后插入儀器樣品槽讀取熒光數(shù)值。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測 取細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠)，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用含有5% 脫脂奶粉和0.05% 吐溫的PBS置室溫封閉1 h，分別加NS3抗體和β-actin抗體置4 ℃孵育過夜，次日加HRP羊抗鼠二抗置室溫孵育2 h后，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測。

1.2.6 熒光定量PCR TRIzol 裂解細(xì)胞后加入氯仿混勻，12 800 g 離心15 min，取上清液加入等量的異丙醇(isopropyl alcohol)， 溫和地上下顛倒數(shù)次，12 800 g 離心15 min。用預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀物后加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。取1 μg RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物參照熒光定量PCR試劑盒試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR。定量引物見表1。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism 6軟件作圖并分析數(shù)據(jù)。組間采用t檢驗比較差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV cured細(xì)胞株Huh 7A和Huh 7B的建立

首先建立HCV亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)。將體外轉(zhuǎn)錄的sg-JFH1 RNA電轉(zhuǎn)到Huh 7細(xì)胞中，3 d后用5 μg/mL的blasticidin進(jìn)行克隆篩選。篩選出2株單克隆細(xì)胞株，命名為6#和8#。

利用IFN-γ分別處理6#和8#HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞，每隔2～3 d用含有IFN-γ培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，3周后換不加IFN-γ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1周，將獲得的2株細(xì)胞株分別命名為Huh 7A和Huh 7B，應(yīng)用熒光定量PCR檢測HCV RNA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，6#和8#細(xì)胞株均檢測出HCV RNA，提示HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞株成功建立；Huh 7、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞內(nèi)未檢測出HCV RNA，提示Huh 7A和Huh 7B是HCV cured 細(xì)胞株(圖1)。

2.2 Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株支持HCV高水平復(fù)制

為驗證Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株是否支持HCV高水平復(fù)制，利用HCV Jc1-G株分別感染Huh 7、Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞，感染72 h后收集上清液和細(xì)胞分別進(jìn)行熒光素酶活性測定、蛋白質(zhì)印跡和熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，與Huh 7相比，Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞上清中Gluc活性水平顯著上調(diào)(圖2A)；Huh 7A和Huh7B

表1 定量PCR引物

Replicon 6# and 8# cells were generated by electroporation of in vitro transcribed sgJc1 RNA into Huh7 cells and selection with blasticidin. The two replicons 6# and 8# cells were treated with interferon gamma and designated as Huh 7A and Huh 7B respectively. HCV RNA levels in indicated cells were quantified by quantitative RT-PCR and normalized against GAPDH RNA levels. Results are reported as mean±s (n=4).

細(xì)胞內(nèi) HCV NS3 蛋白表達(dá)和 HCV RNA拷貝數(shù)相比較Huh 7亦顯著增加，其中HCV RNA水平較Huh 7細(xì)胞顯著增加，與Huh 7.5細(xì)胞內(nèi)病毒RNA水平接近(圖2B、C)。以上結(jié)果提示，所獲得的Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株與HCV cured細(xì)胞株Huh 7.5在HCV易感性方面相似。

2.3 Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株 RIG-I/MDA5/MAVS 的內(nèi)源性表達(dá)

為檢測Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株內(nèi)源性RIG-I/MDA5/MAVS表達(dá)，收集Huh 7、Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞分別進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，與Huh 7細(xì)胞相比，Huh 7A和Huh 7B 細(xì)胞內(nèi)RIG-I內(nèi)源性蛋白表達(dá)輕微下調(diào)，分別降至Huh 7細(xì)胞的60%和80%，但mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，P值分別為0.56和0.14；Huh 7、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞內(nèi)MDA5和MAVS蛋白表達(dá)和mRNA水平皆無顯著差異(圖3A、B)。Huh 7.5細(xì)胞內(nèi)源性RIG-I表達(dá)明顯降低，蛋白水平和mRNA水平分別降至Huh 7細(xì)胞的21%和52%(P<0.05)(圖3A、B)。有趣的是，Huh 7.5細(xì)胞內(nèi)源性MDA5表達(dá)亦顯著下調(diào)，蛋白水平幾乎檢測不到，mRNA水平僅有Huh 7細(xì)胞的27%(圖3A、B)。Huh 7.5細(xì)胞內(nèi)源性MAVS蛋白和mRNA水平輕微上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.32)，見圖3A、B。

Huh 7 cells，Huh 7.5 cells, Huh 7A cells and Huh 7B cells were infected with HCV Jc1G at an MOI of 0.1 for 2 days. A: Gaussia luciferase (Gluc) activity in the supernatant from infected cells is shown. Results are reported as mean±s (n=4). ****P<0.000 1, ****P<0.000 1, ***P=0.000 1. B: HCV RNA levels in the infected cells were determined by quantitative RT-PCR and normalized against GAPDH RNA levels. Results are reported as mean±s (n=3). *P=0.022 1, ***P=0.000 5, **P=0.001 6. C: Western blot analysis of infected cells with antibodies against the proteins indicated. Representative result from three independent experiments is shown.

2.4 Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)表達(dá)較Huh 7細(xì)胞無顯著差異

為驗證Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株中抗病毒效應(yīng)ISGs表達(dá)是否異常，利用IFN-α分別處理Huh 7、Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR檢測ISGs表達(dá)。結(jié)果顯示，Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株isg56，mx1，mx2，oax1，oax2，viperin，cxcl10，ifitm1和ifitm3表達(dá)變化與Huh 7 細(xì)胞株趨勢一致，其mRNA水平與Huh 7細(xì)胞的相比皆無顯著差異；與Huh 7、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株相比，Huh 7.5 ISGs表達(dá)變化和水平亦無明顯差異(圖4A)。

為進(jìn)一步驗證ISGsmx1表達(dá)水平是否異常，利用不同濃度IFN-α分別處理Huh 7、Huh 7.5、 Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞， 應(yīng)用熒光定量PCR檢測mx1表達(dá)。結(jié)果顯示，10 U/mL IFN-α即可提高細(xì)胞內(nèi)mx1 mRNA水平，且隨著IFN-α濃度的增加，mx1表達(dá)水平顯著上調(diào)；但這種變化在4種細(xì)胞之間皆無顯著差異，提示Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株對HCV易感可能與mx1無關(guān)(圖4B)。

A: Western blotting analysis of the endogenous protein expression in Huh 7 cells，Huh 7.5 cells, Huh 7A cells and Huh 7B cells with the indicated antibodies. Gel analysis of proteins in panel A with Image J software. B: Real-time PCR quantification of endogenous RIG-I, MDA5, MAVS mRNA levels in indicated cells. The mRNA levels fold induction was normalized to the Huh 7 group. Results are reported as mean±s (n=4). **P=0.001 4, ***P=0.000 3. Similar results were observed in another independent experiment.

A: Huh 7，Huh 7.5, Huh 7A and Huh 7B cells were seeded and untreated or treated with 500 IU/ml of interferon-alpha for 6 hours respectively. The indicated ISGs mRNA levels were quantified by quantitative PCR and normalized against GAPDH RNA levels. The mRNA level fold induction was normalized to the IFN-untreated groups. Results are reported as mean±s (n=4). Similar results were observed in another independent experiment. B: Huh 7，Huh 7.5, Huh 7A and Huh 7B cells were seeded and treated with 0, 10, 50, 100 and 500 IU/ml of interferon-alpha respectively. Following incubation for 6 hours, the indicated mx1 mRNA levels were quantified and normalized against GAPDH RNA levels. The mRNA level fold induction was normalized to the 0 IU/ml of IFN groups. Results are reported as mean±s (n=4). Representative data from multiple experiments with similar results are shown.

3 討論

目前HCV仍然是嚴(yán)重危害人類健康的重要病原體之一[1]。近年來，一些靶向HCV蛋白的藥物(direct-acting antiviral agent, DAA)被批準(zhǔn)上市，具有抗病毒效果好、副作用小的優(yōu)點，但藥物費用高昂，且部分患者治療效果不佳[7]。雖然針對HCV的治療已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但病毒的生活周期等重要環(huán)節(jié)尚未研究透徹，還需深入探討。Blight等發(fā)現(xiàn)HCV復(fù)制子細(xì)胞經(jīng)過IFN-α處理后顯示出對病毒易感的特性，將其命名為Huh 7.5[4]，該細(xì)胞株是目前唯一公認(rèn)支持HCV高復(fù)制水平的細(xì)胞株。為構(gòu)建支持HCV高復(fù)制水平的細(xì)胞株，本研究采取IFN-γ治療HCV復(fù)制子細(xì)胞策略，分別處理單克隆復(fù)制子細(xì)胞株6#和8#，篩選出2株細(xì)胞株(Huh 7A和Huh 7B)。實驗結(jié)果顯示，在Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株中，病毒基因組中插入的Gluc報告基因活性和病毒RNA復(fù)制水平明顯上調(diào)，病毒蛋白的表達(dá)亦顯著增加，接近Huh 7.5的病毒復(fù)制水平，表明Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株可支持病毒高水平復(fù)制。雖然不同的單克隆復(fù)制子細(xì)胞株中病毒復(fù)制水平存在差別，但本研究獲得的2株HCV cured細(xì)胞株Huh 7A和Huh 7B對HCV易感性并無顯著差異，提示HCV cured細(xì)胞株易感機制可能與宿主細(xì)胞因素相關(guān)。

有文獻(xiàn)報道RIG-I/MDA5/MAVS通路通過識別HCV雙鏈RNA后誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN從而抑制病毒復(fù)制[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)Huh 7.5細(xì)胞內(nèi)RIG-I突變，但在Huh 7細(xì)胞中敲除該基因后并不能增加病毒復(fù)制水平，提示Huh 7.5細(xì)胞對HCV易感可能與RIG-I突變不相關(guān)[9]。本研究檢測Huh 7、Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞中RIG-I/MDA5/MAVS蛋白和mRNA水平，發(fā)現(xiàn)Huh 7.5細(xì)胞表達(dá)RIG-I顯著下調(diào)；有意思的是MDA5表達(dá)亦明顯降低，但這是否與Huh 7.5細(xì)胞對HCV易感相關(guān)還需進(jìn)一步驗證。而Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞中RIG-I/MDA5/MAVS表達(dá)水平與Huh 7細(xì)胞無顯著差異，說明Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞對HCV易感可能與RIG-I/MDA5/MAVS通路無關(guān)，或許存在其他機制。

抗病毒ISGsmx1被報道可能與HCV cured細(xì)胞易感性相關(guān)，有報道發(fā)現(xiàn)用IFN-α刺激HCV cured細(xì)胞，抗病毒基因mx1激活倍數(shù)顯著減少，敲除該基因后病毒復(fù)制水平增加，而回補該基因則抑制病毒復(fù)制[10]。本研究用IFN-α處理4種細(xì)胞并檢測已報道的具有抗病毒效應(yīng)的ISGs激活水平，發(fā)現(xiàn)無論在Huh 7.5細(xì)胞還是在Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞中，ISGs的激活水平均與Huh 7細(xì)胞中的一致。為進(jìn)一步驗證mx1與Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞HCV易感相關(guān)性，用不同濃度的IFN-α處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)4種細(xì)胞中mx1激活水平隨著IFN劑量增加而增加，激活倍數(shù)無顯著差異，說明不同株的HCV cured細(xì)胞其易感性機制不同。

綜上所述，對HCV cured細(xì)胞易感性雖有不少研究，但具體機制尚存在爭議。下一步我們將在Huh 7.5、Huh 7A和Huh 7B細(xì)胞株中繼續(xù)探索易感機制，為建立更好的細(xì)胞模型提供理論基礎(chǔ)，從而為病毒學(xué)基礎(chǔ)研究提供有力工具。