徐關(guān)林，陳光富

（麗江師范高等?？茖W(xué)校應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，云南麗江674199）

在自然界中，大型真菌是生物多樣性的重要組成部分，其種類多、分布廣，從用途上可簡單分為食用菌、藥用菌、毒菌3 類。我國對大型真菌的利用歷史悠久，《唐本草注》、《菌譜》和《本草綱目》等文獻資料中就有對大型真菌利用的早期記載[1-2]。大型真菌標本是菌類研究[3]、生物教學(xué)、科普宣傳等方面的重要憑證和展示材料，因此能否制成一份優(yōu)良的標本對教學(xué)效果、鑒定結(jié)果和研究結(jié)論會產(chǎn)生一定影響。大型真菌標本主要包括浸制標本、干制標本、外形和剖面標本及孢子印制取等4 類[4-5]，選取方法需根據(jù)真菌類型、標本用途決定，其間的差異主要體現(xiàn)在藥品選擇、制作工序、處理時間等方面。該文對文獻記錄進行梳理總結(jié)，歸納大型真菌標本制作的常用方法，以期為教學(xué)、科研和標本管理提供基礎(chǔ)參考。

1 浸制標本制作

大型真菌浸制標本，因可以保持原有形態(tài)特征，便于鑒定，因此在教學(xué)活動和科普教育中常作為重要展示材料，該方法主要應(yīng)用于肉質(zhì)化明顯的真菌。標本制作時一般先配制好保存液直接保存或用固定液預(yù)處理，具體步驟包括：①將子實體清洗干凈后放入透明標本瓶中，然后將事先制備好的保存液倒入；②如果標本會浮起還需栓上玻璃片或玻璃棒，要確保標本浸泡在保存液中；③密封瓶口后避光放置；④標本瓶上貼采集及鑒定標簽，然后入庫保存。保存液通常用酒精（70%）和福爾馬林按50∶3或200∶1 的比例，或用甲醛、酒精（80%）按3∶7 的比例，或甲醛10 mL、硫酸鋅25 g、蒸餾水1000 mL 的比例配制而成[4，6-9]。

浸制標本會因長期浸泡而使保存液變渾濁，甚至讓標本褪色，因而需頻繁更換保存液。程地林等[17]以竹蓀為試驗材料對保存液進行改良研究，結(jié)果顯示以甲醛（37%～40%）∶蒸餾水∶無水二氯化鈣（10%）=1∶8∶1 比例配制的保存液保存標本8 年，未見標本褪色、保存液渾濁等現(xiàn)象，從而提升保存效果和降低藥品的使用量，降低成本。牛寶清通過研究比較NaCl、EDTA、甲醛、酒精、CTAB等試劑對真菌組織塊的保存效果，認為無水乙醇（100%）的綜合保存效果最優(yōu)[10]，但由于酒精會引起組織收縮和硬化，而冰醋酸會使組織輕微膨脹，因此，有學(xué)者在制作浸制標本時會在保存液中添加一定比例的冰醋酸，用以提升保存效果[11]。

浸制標本相對于干制標本具有明顯優(yōu)勢，比如制作過程節(jié)省時間、可以保持子實體原有形態(tài)等，從而便于教學(xué)與鑒定[9]。但也存在一定缺陷，比如需浸泡在標本缸內(nèi)，這無疑增大了保存空間，且不便于隨時攜帶。如想獲得色澤更佳的標本，則需根據(jù)菌類顏色深淺而配制試劑，且深顏色菌類還要根據(jù)其色素是否溶于水再選擇合適的制作方法。

1.1 白色或淺色類大型真菌標本制作

對白色或淺黃等淺顏色的大型真菌，通常用甲醛（5%）、酒精（70%）或兩者的混合液進行浸泡，也有學(xué)者按硫酸鋅25 g、福爾馬林10 mL、水1000 mL 的比例或硫酸鋅2.5 g、甲醛l0 mL、水1000 mL 和甲醛∶酒精（50%）∶水=1∶6∶40 的比例配制浸泡液[5，12-13]。楊琴等[14]以金針菇、雞腿菇、平菇、香菇等食用菌為研究對象進行研究，結(jié)果顯示以上菌類更加適合先固定后保存的處理方式，且需根據(jù)子實體的性質(zhì)適當調(diào)整保存液配制比例，浸制效果較好，比如金針菇按甲醛∶酒精（50%）∶冰醋酸=2∶17∶1 的比例，雞腿菇按甲醛∶酒精（70%）∶冰醋酸=9∶182∶9 的比例；平菇按甲醛∶冰醋酸∶氯化鉀水溶液（10%）∶蒸餾水=2∶1∶2∶15 的比例配制。

1.2 深色類大型真菌標本制作

深色大型真菌，在制作浸制標本時常用藥品主要包括醋酸汞、冰醋酸、酒精、硫酸銅、無水亞硫酸鈉、濃硫酸等[12]。在制作深色大型真菌標本時應(yīng)該著重考慮子實體所含色素是否溶于水，再選擇合適的藥品配制保存液。

（1）色素溶于水，易導(dǎo)致子實體褪色，在處理這一類子實體時要選擇可防止色素溶于水的藥品。保存液通常按1 g 醋酸汞∶1000 mL 乙醇（90%）∶10 g 中性醋酸鉛∶10 mL 冰醋酸的比例或用1 g 醋酸汞∶990 mL 乙醇（90%）∶10 g 中性醋酸鉛∶10 mL 冰醋酸的比例進行配制[5，13，15]

（2）色素不溶于水，一般先用固定液預(yù)處理，其后用保存液保存。固定液參考福爾馬林（40%）∶蒸餾水= 1∶7 的比例配制，固定液預(yù)處理1 h，用保存液換洗2～3 次后浸泡至保存液中保存[16]。有學(xué)者提出將子實體直接浸泡至保存液中，保存液參照冰醋酸10 mL∶醋酸汞10 g∶蒸餾水1000 mL 或冰醋酸5 mL∶升汞10 g∶蒸餾水1000 mL 的比例配制[5，13]。

2 干制標本制作

大型真菌干制標本是指通過加熱或冷凍等方式，使子實體脫水而制成的標本。因子實體脫水，標本會發(fā)生變形，失去原有形態(tài)不好鑒定，這給教學(xué)展示、分類鑒定等帶來很大弊端，但干制標本在制作方法上相對浸制標本具有更簡單和方便攜帶，所需保存空間小等優(yōu)勢。子實體呈革質(zhì)、栓質(zhì)類的大型真菌一般制成干制標本，肉質(zhì)化類大型真菌根據(jù)需要也可制成干制標本。

2.1 烘干制作方法

干制標本可直接采取日曬、風(fēng)干、火烘烤、紅外燈照射、硅膠吸水干燥、恒溫干燥箱烘干等方法制作[5，13]，李亞平等提出先將大型真菌曬干后用清水浸泡，將清水瀝干后放置在60℃的恒溫箱內(nèi)烘烤48 h 的方法，標本未出現(xiàn)霉爛和蟲蛀等情況[18]。使用火烘烤時需注意保持標本與火焰的距離和烘烤時間，或?qū)⒆訉嶓w放在鐵皮、瓦片等隔熱板上烘烤，以避免直接接觸火焰烤焦標本[6]。硅膠吸收子實體內(nèi)水分后，會由原本的藍色變成粉紅色，曬干后便可重復(fù)使用，因此為確保標本充分干燥，需要持續(xù)更換硅膠直至硅膠不再變色為止[8-9，12，15]。采用恒溫箱烘干，如果是革質(zhì)或木質(zhì)化類大型真菌直接設(shè)置在105℃下烘干[9]，如果是其他類型菌類，先將子實體縱向剖開，在50～60℃下烘烤6～8 h，然后通風(fēng)回潮20～30 min[7，19]。干制標本制作完成后要放入標本盒或標本袋內(nèi)，貼上標簽，同時放入樟腦等防腐劑，若是貯存的地方比較濕潤，還要放入一些干燥劑。

2.2 冷凍干燥制作方法

冷凍干燥的方法亦可制作干制標本，并且效果較好。羅國濤[20]通過對電熱烘箱、標本夾壓制、電冰箱冷凍3 種干制法的對比研究，結(jié)果顯示，通過電冰箱冷凍干制法得到的標本效果最佳，且操作方法簡易。主要步驟包括：①將子實體清洗干凈后放入冰箱的冷凍層；②將其溫度調(diào)到最強檔，注意標本不能被凍結(jié)；③持續(xù)冷凍7～10 d 便可獲得冷凍干制標本。陳淑榮和欒玲玲[15]在冷凍干燥的基礎(chǔ)上進行了改進，對清洗干凈的新鮮標本進行冷凍干燥，其后將其浸泡在聚氨基甲酸乙酯的酒精液中，處理后又將其放入干燥箱內(nèi)進行恒溫烘干。該方法使得子實體表面產(chǎn)生了一層保護層，更利于保存。

因干制標本易變形，針對如何確保干制標本完整性和色澤保持等問題，李朋員等[21-22]開展相關(guān)研究，采用自制處理液對標本進行預(yù)處理后晾干，從而使子實體保持原有形態(tài)和顏色。具體步驟包括：①往40℃的水浴鍋內(nèi)加入600 mL 甲醛溶液，待其溫度回升到40℃時，取400 g的尿素分多次倒入并不斷攪拌，徹底溶解后備用；②用25%（2 h）、50%（2 h）和100%（12 h）等不同濃度梯度處理液對大型真菌進行浸泡；③將100%濃度的處理液注射入菌體內(nèi)；④用竹簽將子實體整形固定后晾干；⑤將用20%聚乙烯吡咯烷酮K-30 和80%酒精配制而成的處理液均勻涂抹至晾干的菌體表面；⑥再將菌體放至恒溫箱烤干后，放入透明玻璃標本展示瓶。

3 外形和剖面標本制作

此種方法主要適用于肉質(zhì)化較為明顯的大型真菌。制作步驟包括：①將動物膠原（15%）均勻涂抹在加厚白紙上，自然干燥備用；②先將子實體從下到上縱向剖開；③選擇將其中一半子實體的菌柄和菌蓋內(nèi)菌肉去除，另一半繼續(xù)縱切成薄片，要求切成的薄片能充分展示該菌的特征；④將去除菌肉的子實體、切片粘貼在白紙上，讓材料平整并能展示真菌的外形和剖面特征；⑤在標本上覆蓋多層紗布進行壓制，干燥后連同白紙粘貼在臺紙上并填寫標簽[4-5]。

4 孢子印制取方法

不同大型真菌的孢子形態(tài)、顏色、分布密度等方面均有差異，因此采集的菌類常制取孢子印標本進行分類鑒定，這種方法主要應(yīng)用于傘菌類鑒定。制作步驟包括：①選取不同對比色的硬卡紙，然后平鋪在試驗桌面上；②將已經(jīng)切除菌柄的菌蓋菌褶向下平鋪在硬卡紙上，或用鐵絲制作簡易的支撐圓環(huán)置于菌蓋下面；③在菌蓋上面罩上培養(yǎng)皿或燒杯使制取空間密封，靜置數(shù)小時后取下容器和菌蓋進行觀察，具體的靜置時間根據(jù)不同真菌適當調(diào)整；④為使孢子能夠長期保存在硬卡紙上不脫落，需涂上白乳膠、膠水或新雞蛋清提取液等，同時粘貼采集標簽和填寫采集信息，過塑后保存[4，5，8，13，15，23]。

5 展望

在選擇制作方法時應(yīng)充分考慮制作環(huán)境、菌類性質(zhì)、數(shù)量以及標本用途等因素，經(jīng)多次試驗后再進行選擇。如有條件，可同時制備幾類標本進行保存，這樣可以彌補各自存在的缺點。隨著科技水平發(fā)展和對大型真菌研究的不斷深入，在教學(xué)和研究工作中應(yīng)不斷結(jié)合最新研究方法，提高物種鑒定的精準性和保存效果，比如利用分子生物學(xué)方法開展ITS 序列分析鑒定，提升大型真菌野外實踐的教學(xué)效果等[24]。同時，標本制作方法也應(yīng)不斷革新，應(yīng)該積極融入數(shù)字化手段，比如引用3D 建模技術(shù)等來建立數(shù)字化標本，配合實物標本開展教育教學(xué)活動及科學(xué)研究工作，這將更有利于資源共享。