肖 歡

（甘肅省兩當(dāng)縣畜牧獸醫(yī)站太陽分站，甘肅 兩當(dāng) 742400）

當(dāng)前動物實(shí)驗(yàn)室使用較頻繁的檢測方法為血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI），該試驗(yàn)屬于血清診斷范疇，通過病毒體現(xiàn)出的凝集紅細(xì)胞特性進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的判定。普遍被應(yīng)用在已知病毒的血清檢測中，也是動物實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用廣泛的實(shí)驗(yàn)方法之一。此試驗(yàn)檢測過程體現(xiàn)出特異性佳、操作簡便、可集中處理大量樣本以及對試驗(yàn)環(huán)境要求簡單等優(yōu)點(diǎn)。即便如此，該試驗(yàn)檢測方法應(yīng)用不當(dāng)時(shí)，會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致試驗(yàn)失效。

1 血凝抑制試驗(yàn)的常規(guī)應(yīng)用

1.1 抗體水平的監(jiān)測

完成疫苗免疫的雞群，HI抗體效價(jià)保持在特定水平，如果利用弱毒活疫苗對雞群進(jìn)行免疫后，HI抗體的值能夠達(dá)到1：16～1：64（4㏒2～6㏒2）；如果利用油劑滅活苗對雞群進(jìn)行免疫，HI抗體的值能達(dá)到1：256～1：512（8㏒2～9㏒2），頂峰時(shí)值能達(dá)到1：2048（11㏒2）。HI試驗(yàn)可以被設(shè)定為有效的免疫檢測手段，可以有效避免免疫失敗情況的發(fā)生。

1.2 鑒定某些病毒

很多病毒都會對動物的紅細(xì)胞造成凝聚影響，此特性會被特異性抗血清抑制。換言之，當(dāng)雞新城疫的血清與雞新城疫病毒相遇會發(fā)生中和反應(yīng)，但是不會與禽流感病毒發(fā)生中和反應(yīng)?；诖耍逯泻蛯?shí)驗(yàn)可以對已知病毒進(jìn)行判定，還可以用于判斷雞血清中有無特異性抗體，進(jìn)一步確定雞群感染新城疫的情況。

2 提升HA和HI準(zhǔn)確率的操作

2.1 緩沖液的操作

2.1.1 緩沖液的種類。在展開血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，兩者使用的緩沖液存在明顯差異，常見的緩沖液包括兩種，第一種生理鹽水；第二種磷酸鹽緩沖液。

在常規(guī)的禽流感抗體檢測檢驗(yàn)中，會選用濃度85%的生理鹽水作為緩沖液，因?yàn)楫?dāng)生理鹽水的濃度超過85%后，容易導(dǎo)致紅細(xì)胞出現(xiàn)非特異性凝集，但是生理鹽水并不能持續(xù)具備反應(yīng)系統(tǒng)pH值的能力。而磷酸鹽緩沖液具備此能力。利用磷酸鹽緩沖液展開禽流感抗體檢測，獲取的抗體效價(jià)與利用生理鹽水相較，體現(xiàn)出明顯的檢出率優(yōu)勢?；诖?，禽流感凝血實(shí)驗(yàn)與凝血抑制檢測實(shí)驗(yàn)最佳的緩沖液應(yīng)為磷酸鹽。明顯提升檢出率的同時(shí)，有效避免了非特異性凝聚。需要特別指出的是，與磷酸鹽配合使用的Na2HPO4含有水分子，應(yīng)合理把控用量，在滅菌處理后還需要對pH值進(jìn)行調(diào)整。

2.1.2 緩沖液的pH值。無論在試驗(yàn)過程中選用哪種緩沖液，都應(yīng)注意合理pH值的設(shè)定。病毒血凝性最適宜的pH值應(yīng)控制在6.0～7.2之間。當(dāng)pH＜5.8時(shí)，紅細(xì)胞增加了聚集結(jié)塊風(fēng)險(xiǎn)，或者會發(fā)生破裂溶血現(xiàn)象。pH＞7.8時(shí)，聚集紅細(xì)胞發(fā)生加速解聚變化，導(dǎo)致原本吸附在紅細(xì)胞上的病毒脫落。如果使用生理鹽水為緩沖液，7.2＜pH＜6.4時(shí)，容易導(dǎo)致紅細(xì)胞破潰溶血問題的發(fā)生。綜合來講，利用磷酸鹽緩沖液展開試驗(yàn)時(shí)，最佳的pH值范圍為：6.0＜pH＜7.2，而生理鹽水為緩沖液展開試驗(yàn)時(shí)，最佳的pH值范圍為：6.4＜pH＜7.2。所以，為提升試驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)性，可以將pH值確定在6.4～7.2之間，當(dāng)pH值被確定在7.0～7.2之間時(shí)，血沉是最充分的，試驗(yàn)中圖形的可辨性也是最高的，直接通過觀察可以完成精準(zhǔn)性較高的結(jié)果判定。出于pH試紙存在誤差的考慮，可以在試驗(yàn)過程中將pH值控制在7.0，此措施的有效性在眾多的試驗(yàn)檢測中已經(jīng)得到驗(yàn)證。

2.1.3 緩沖體系統(tǒng)一。在整體試驗(yàn)過程中，當(dāng)涉及緩沖液使用時(shí)，應(yīng)確保使用的緩沖液統(tǒng)一，特別是在1%雞紅細(xì)胞配置過程中，一定要避免生理鹽水的使用，應(yīng)嚴(yán)格按照試驗(yàn)所需的緩沖體系實(shí)施操作。

2.2 溫度的控制

在展開HA和HI操作時(shí)，溫度的精確控制也是提升檢測準(zhǔn)確率的有效方法。當(dāng)試驗(yàn)溫度處于4～37℃范圍內(nèi)時(shí)，當(dāng)溫度提升5℃時(shí)，HI效價(jià)會明顯發(fā)生改變，平均提升0.35㏒2。當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)不到4℃時(shí)，會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，應(yīng)對反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長。此時(shí)的紅細(xì)胞非常容易發(fā)生聚集。當(dāng)環(huán)境溫度高于37℃時(shí)，抗原能活躍，會大量釋放神經(jīng)氨酸酶，導(dǎo)致紅血球表面因?yàn)槭艿狡茐亩鴨适Ь凵⒛芰?，最終從紅血球上脫落，最終導(dǎo)致溶血的發(fā)生。當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，容易因?yàn)橐后w蒸發(fā)過快而對反應(yīng)體系、各組比例造成影響，反應(yīng)體系與比例失調(diào)都會直接影響到抗原活性——下降，造成試驗(yàn)失效的嚴(yán)重后果。綜前所述，試驗(yàn)的最佳溫度應(yīng)控制在18～22℃之間，特別是在炎熱的夏天展開試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先將試驗(yàn)環(huán)境衡定在恰當(dāng)溫度范圍內(nèi)再展開試驗(yàn)。

2.3 時(shí)間的控制

在進(jìn)行測定血凝效價(jià)后，很多情況會對持續(xù)展開HI試驗(yàn)產(chǎn)生制約，具體情況包括：隔天展開HI試驗(yàn)、進(jìn)行了紅細(xì)胞懸液的更換、進(jìn)行了抗原的更換。當(dāng)上述三種情況發(fā)生時(shí)，都需要對血凝效價(jià)進(jìn)行重新測定。常規(guī)情況下，在HA試驗(yàn)加入紅細(xì)胞20min后，可以隨時(shí)讀取觀察結(jié)果，直到對照孔出現(xiàn)100%凝集現(xiàn)象，空白對照孔的液體足夠清澈透亮后，再完成結(jié)果的最終判定。

在展開HI試驗(yàn)過程中，孵育過程的時(shí)間與溫度成反比，最適宜試驗(yàn)展開的溫度值為18～22℃之間，孵育在20～40min之間。當(dāng)孵育時(shí)間不足，會導(dǎo)致血清中的抗體與抗原之間的反應(yīng)不徹底，凝聚欠佳，導(dǎo)致后續(xù)紅細(xì)胞與血清中的抗體進(jìn)行抗原爭奪。當(dāng)孵育時(shí)間太長，抗原會釋放出大量神經(jīng)氨酸酶，對紅細(xì)胞造成嚴(yán)重影響，致其脫落或裂解。所以，將孵育時(shí)間控制在20min，以陰性與陽性的對照孔反映情況為信號，陰性對照孔表現(xiàn)出完全沉淀，陽性對照孔表現(xiàn)出凝集時(shí)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察。淚滴徹底流淌，與對照孔的淚滴大小、淚痕流動速度、淚線粗細(xì)非常相似時(shí)，最后孔作為判定結(jié)果。