陳育青， 朱善嵐， 黃紅宣， 楊成梓 ， 呂大偉, 王小平

陳皮(Citri Reticulatae Pericarpium)別稱橘皮，為蕓香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果實的果皮，最早記載見于《神農本草經》，其味苦、辛，性溫，歸肺、脾經，其功效為理氣健脾，燥濕化痰，主治脘腹脹滿，食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[1]。陳皮主要含有黃酮和揮發(fā)油兩類成分，具有抗炎、保肝、降壓、降血脂、抗氧化等作用。橙皮苷、川橙皮素、橙皮素和柚皮苷等為陳皮黃酮類的主成分，其中前3種是陳皮重要的活性成分，含量較高，具有較強的抗氧化和抗癌活性[2-6]。陳皮炮制有炒制、醋炙、焙制、麩制、黑豆制、鹽炙、制炭、巴豆炒、酒浸、米泔水浸、熬法制、米制、米炒、面炒、姜汁炒、童便制、土炒、香附炒制、蜜炙等20種方法[7]?！陡＝ㄊ≈兴幣谥埔?guī)范》(2012年版)收載生品、鹽制、制陳皮。2015年版《中華人民共和國國藥典》陳皮僅收載生品入藥。

福建省漳州市作為閩南中藥炮制技術的代表，有著悠久的歷史?！墩闹菔谐Ｓ弥兴幖庸づ谥品ā分惺蛰d四制陳皮，炮制技術獨特，具有閩南特色。漳州四制陳皮分別采用甘草水、醋、姜、鹽等四種輔料炮制，其中甘草水制治火痰、姜汁炙治寒痰、鹽炙治燥痰、醋炙治郁痰；經四制后可引藥入肝、下焦，且使其溫而不燥，不僅增強其理氣開胃、降氣化痰作用，同時兼具行氣解郁之功[8]。不同炮制品陳皮功效有所側重，如麩炒陳皮側重醒脾溫胃，土炒陳皮側重化痰止嘔。本研究采用多波長高效液相色譜法測定四制陳皮、蒸陳皮、生品陳皮等不同炮制方法中橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的含量，對不同炮制品陳皮黃酮類成分含量差異性進行比較，闡明漳州四制陳皮的品質特色，為后續(xù)炮制工藝及炮制原理研究提供依據。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑 橙皮苷標準品(批號：MUST-18032502)、橙皮素標準品(批號：MUST-18040804)和川陳皮素標準品(批號：MUST-18042205)均購自成都曼斯特生物科技有限公司。HPLC用乙腈為色譜純，其余試劑皆為分析純。

1.1.2儀器 高效液相色譜儀(Agilent1260，美國安捷倫公司)，電子分析天平(AB265-S型，瑞士梅特勒-托利多公司)，精密型超純水機(FST-Ⅲ-10，上海富詩特公司)和超聲波清洗器(KQ5200，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1炮制樣品制備

1.2.1.1四制陳皮的制備 生陳皮購自福建漳州市長泰縣，經筆者醫(yī)院中藥教研室鑒定為蕓香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。原藥揀去雜質洗凈，曬干。按每100 kg陳皮配甘草5 kg、生姜5 kg、食鹽5 kg和醋5 kg，四味煎湯去渣，投入凈陳皮熬至藥湯吸盡為度，撈起曬干即成[8]。

1.2.1.2其他陳皮炮制樣品制備 蒸陳皮：取陳皮，除去雜質，濕潤后，蒸透，取出，切絲，低溫干燥[9]。炒陳皮：取凈陳皮絲，文火炒至深黃色，取出，放涼[10]。麩炒陳皮：取凈陳皮絲，用麩皮拌炒至內表面呈黃色，篩去麩皮晾干[11]。土炒陳皮：將鍋用文火加熱，放入灶心土細粉，待翻動土粉呈較輕松狀態(tài)時，倒入凈陳皮絲，翻炒至表面掛勻土粉，微帶焦斑時，及時取出，篩去土粉，晾干[12]。蜜陳皮：每100 kg 陳皮用煉蜜19 kg[13]，取煉蜜加適量開水稀釋，加入凈陳皮拌勻，悶透，置鍋內，用文火加熱，炒至老黃色不粘手時，出鍋，晾干。鹽陳皮：凈陳皮100 kg，用食鹽3 kg[14]，將食鹽加適量水化開，倒入凈陳皮拌勻，稍悶潤，置鍋內，用文火加熱炒至色澤變深，出鍋，晾干。醋陳皮：每1 kg陳皮飲片用醋200 g[15]，取陳皮飲片，置容器內，加醋拌勻，悶潤，吸盡，用文火炒至外表面呈黃褐色至棕褐色，略有焦斑，取出，晾干(性狀特征見表1)。

1.2.2溶液配制

1.2.2.1混合對照品溶液的配制 以甲醇為溶劑，按每毫升含195 μg橙皮苷、185 μg橙皮素和198 μg川陳皮素配制混合對照品儲備溶液。

1.2.2.2供試品溶液的配制 分別取不同炮制品陳皮適量，粉碎后過60目，稱取各粉末0.5 g，加甲醇定容至50 mL，密封，超聲處理30 min(200 W功率和40 kHz頻率)，置冷，混勻后過濾，即得供試品溶液。

1.2.3色譜條件 色譜柱：Inertsustain C18柱(5 μm，4.6×150 mm)；流動相：0.1%磷酸水-乙腈溶液，梯度洗脫(0～6 min：23% C→28% C，6～19 min：28% C→35% C，19～30 min：35% C→45% C)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm(0～6 min，橙皮苷)、283 nm(6～19 min，橙皮素)、334 nm(19～30 min，川陳皮素)；柱溫：35 ℃。

表1 陳皮不同炮制品性狀特征及炮制依據

2 結 果

2.1測定 取混合對照品溶液適當稀釋，分別吸取稀釋液與供試品溶液20 μL，注入色譜儀進行分析，記錄色譜圖。結果見圖1。在該色譜條件下，橙皮苷、橙皮素和川陳皮素的保留時間分別為5.133，16.758，25.546 min，與相鄰色譜峰均能達到基線分離，峰形良好，且保留時間與色譜分析時間適宜。生陳皮與炮制品陳皮的指紋圖譜區(qū)別明顯，表明其成分發(fā)生改變。四制陳皮在保留時間7～9 min時間段，3個色譜峰消失；陳皮生品在保留時間12～13 min 時間段有2個色譜峰，其余炮制品均未見色譜峰；僅四制陳皮、蒸陳皮、清炒陳皮、土炒陳皮檢出橙皮素色譜峰，但后三者峰信號極弱。

2.2線性關系分析 分別精密吸取2.2.1項下各混合對照品溶液適量，加甲醇進行逐次稀釋，得到系列濃度的標準工作溶液，按2.1項下色譜條件進樣檢測分析，以樣品濃度X(mg/g)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程：

橙皮苷：Y=143 866X-9 876，r2=0.999 6

橙皮素：Y=562 973X+7 661，r2=0.999 9

川陳皮素：Y=388 335X-22 709，r2=0.999 7

結果表明，橙皮苷在1.950～78.00 mg/g、橙皮素在0.370～14.80 mg/g、川陳皮素在0.396～15.84 mg/g 范圍內樣品濃度與峰面積呈良好線性關系。

2.3精密度試驗 量取20 μL相同濃度的混合對照品溶液，進樣測定，重復5次。色譜圖記錄結果顯示橙皮苷、橙皮素和川陳皮素峰面積的RSD分別為0.61%，0.58%及0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗 精密稱取四制陳皮樣品0.5 g，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0，2，4，8，16 和24 h后分別取樣測定，結果顯示橙皮苷、橙皮素和川陳皮素峰面積的RSD分別為0.77%，0.95%和0.82%，表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩(wěn)定性。

2.5重復性試驗 精密稱取四制陳皮樣品0.5 g 5份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，結果按干燥品計算，樣品中橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的平均質量分數(shù)分別為77.022 mg/g(RSD=1.87%),0.434 mg/g(RSD=2.63%)和6.684 mg/g(RSD=2.00%)。

2.6加樣回收率試驗 稱取已知含量的四制陳皮樣品0.25 g，共 6份，每份分別精密加入每1 mL含橙皮苷、橙皮素和川陳皮素為9.75，185和1.98 mg的混合對照品溶液1 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定。結果表明，橙皮苷、橙皮素和川陳皮素平均回收率分別為97.82%(RSD=1.94%)，101.59%(RSD=1.87%)和98.83%(RSD=1.81%)。

2.7樣品含量測定 分別精密稱取不同炮制方法陳皮樣品，按照2.2.2項下方法配制供試品溶液，依法測定。用外標法，按干燥品計算樣品中橙皮苷、橙皮素和川陳皮素的平均質量分數(shù)。結果見表2。

表2 不同陳皮炮制品中橙皮苷、橙皮素、川陳皮素含量測定

由表2可知，不同炮制品中橙皮苷的含量有差異，依含量高低依次為：四制陳皮>蒸陳皮>麩炒陳皮>炒陳皮>醋陳皮>蜜陳皮>陳皮生品>土炒陳皮>鹽陳皮。其中，四制陳皮橙皮苷含量明顯高于其他炮制品，且只有四制陳皮檢測到橙皮素的含量。

2.8化學模式識別分析

2.8.1系統(tǒng)聚類分析 將各樣品化學物質含量相對于稱樣量量化，導入SIMCA-P 14.1軟件對樣品進行系統(tǒng)聚類分析[16]。9個樣品基本可分為3大類(圖2)，S1聚為第1類，S2聚為第2類，S3～S9聚為第3類。

2.8.2樣品主成分分析 分別將9個樣品色譜峰信息輸入Excel 表格內，得到樣品個數(shù)×各峰面積數(shù)的數(shù)據矩陣，采用SIMCA-P 14.1軟件進行PCA分析[17-18](圖3)。結果顯示9個樣品大致可分3組，與系統(tǒng)聚類分析結果相一致。

2.8.3偏最小二乘法-判別分析 分別將9個樣品峰面積信息輸入Excel 表格內，得到樣品個數(shù)×各峰面積數(shù)的數(shù)據矩陣，導入SIMCA-P 14.1軟件中進行PLS-DA模型擬合，使用Ctr換算的數(shù)據標度方式進行標準化處理[19-20]。圖4為生成差異性標記物的變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)，其中VIP>1的成分6個，其影響大小依次為色譜峰P3(橙皮苷)、P21、P22、P20、P23(川陳皮素)、P15(橙皮素)，表明以上成分是不同陳皮炮制品之間成分差異的主要標記物，對陳皮質量差異有較大的影響。

3 討 論

本研究采用多波長HPLC檢測方法，利用二極管陣列檢測器的時間波長程序的特點，使檢測波長隨時間變化而變化，可實現(xiàn)在各自最佳波長條件下多指標成分，多波長單行檢測，獲得與單一波長分析相似效果。該方法具有操作簡便和穩(wěn)定可靠的優(yōu)勢。

陳皮的成分復雜，其功效亦多樣。2015年版《中國藥典》一部主要以含量較高的橙皮苷作為陳皮的檢測指標，不足以體現(xiàn)陳皮的多成分和多功效等特點。僅以測定單一成分作為質控，也難以較好地鑒定陳皮的內在質量。因此，建立以多成分指標的含量測定為主的陳皮質量檢測方法體系，顯得更為科學可靠[2]。本研究基于多波長HPLC檢測以及化學模式識別技術分析，建立閩南漳州陳皮生品與炮制品的質量檢測方法體系，明確樣品間的歸類屬性，3種化學模式識別方法(HCA、PCA和PLS-DA分類模型)結果一致，均可鑒別陳皮生品與炮制品。本研究結果也表明陳皮生品與炮制品之間存在明顯的差異，而且經 PLS-DA 篩選到陳皮6個主要差異性成分，鑒別其中3個成分(橙皮苷、橙皮素和川陳皮素)，為多角度控制該藥材質量提供可靠數(shù)據。

黃酮類成分是陳皮的一大類活性成分，具有多樣性藥效，比如抗氧化、抗變態(tài)性反應、抗炎癥、降血脂和保護心血管以及抗腫瘤等功效[21]。2015年版《中國藥典》陳皮為陳皮生品，以橙皮苷含量作為評價陳皮質量的指標。本研究結果表明，陳皮經炮制后黃酮類成分有差異，四制陳皮、蒸陳皮、麩炒陳皮、炒陳皮、醋陳皮炮制后的黃酮類成分含量比生品陳皮的高?！帮嬈胨?，生熟異用”是中醫(yī)臨床的用藥特點，不同炮制方法對中藥藥性和藥效產生著不同的影響。陳皮不同炮制品在中醫(yī)的不同處方中發(fā)揮著不同的藥效。本研究表明，閩南漳州四制陳皮橙皮苷含量明顯高于生陳皮和其他陳皮炮制品，且檢測出橙皮素成分；生陳皮和其余7種陳皮炮制品未檢出橙皮素成分。橙皮素為一種二氫黃酮，是橙皮苷的苷元。橙皮苷為大分子化合物，其生物利用度較低，轉化為苷元橙皮素后，可極大提升其生物利用度，更易于體內吸收。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，橙皮素具有抗阿爾茨海默病、抗帕金森病、抗纖維化等作用[22]，這與閩南漳州四制陳皮取其降氣、化痰、解郁之功一致。由此說明閩南漳州四制陳皮的炮制方法具有很好的品質特色，值得傳承與推廣。橙皮素的產生可能與炮制過程中經過高溫與輔料共同作用所致，后續(xù)還將進一步深入研究。

本研究運用現(xiàn)代手段分析陳皮不同炮制方法中黃酮類成分存在的差異，闡述了閩南漳州四制陳皮在工藝和成分上的品質特色，為后續(xù)探討炮制工藝和臨床用藥提供依據，同時對保護和傳承閩南地區(qū)傳統(tǒng)炮制技術具有深遠的意義。