覃信梅 盤波 盧永彬 沈利娜 張強 梁燕妮

摘 要：? ?石山苣苔屬（苦苣苔科）約41種，主要分布于我國西南石灰?guī)r地區(qū)。到目前為止，僅其中四種的染色體數目被研究和報道，其余絕大多數物種的染色體數目和倍性尚不清楚，染色體數目和倍性在該屬及其姐妹屬報春苣苔屬中的演變歷史及其對兩屬物種多樣性分化的影響亦不清楚。該文以葉片水培生根法獲取的四種（含一變種）石山苣苔屬植物 [即石山苣苔原變種（Petrocodon dealbatus var. dealbatus）、齒緣石山苣苔（Petrocodon dealbatus var. denticulatus）、弄崗石山苣苔（Petrocodon longangensis）、石山苣苔未定名種（Petrocodon sp.）]的根尖細胞為材料開展染色體實驗，探索了多種不同的實驗條件對染色體制片效果的影響并獲取染色體數目，在石山苣苔屬和報春苣苔屬的系統(tǒng)樹上追蹤了染色體數目和倍性的演變歷史，同時探討染色體數目尤其是倍性變化是否對兩屬物種多樣性分化存在影響。結果表明：（1）長度為1～1.5 cm的根尖，0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液預處理5 h，解離4 min為較適宜的染色體制備條件。（2）四種（含一變種）石山苣苔屬植物染色體數目一致，均為二倍體（2n=2x=36）。（3）兩屬之間及兩屬各自的最近共同祖先染色體數目尚不能確定，除個別物種染色體條數或倍性有變化以外，其余已知染色體數目的物種均為2n=2x=36，在兩屬中高度一致，石山苣苔屬與報春苣苔屬物種多樣性分化尤其兩屬物種多樣性巨大差異與染色體數目和基因組倍性變化無關。綜上結果為石山苣苔屬植物及其近緣類群染色體制備提供了參考，也為進一步對該類群的分類、系統(tǒng)演化和物種形成等方面的研究提供了基礎數據和啟示。

關鍵詞：? 石山苣苔屬， 染色體數目， 基因組倍性， 物種分化

中圖分類號：? ?Q949

文獻標識碼：? ? A

文章編號：? ?1000-3142（2020）10-1466-11

Chromosome numbers and ploidy of four species （including one variety） in Petrocodon Hance

QIN Xinmei1， PAN Bo1， LU Yongbin1， SHEN Lina3， ZHANG Qiang1， LIANG Yanni2*

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China; 2. Wuzhou University， Wuzhou 543000， Guangxi， China; 3. Key Laboratory of Karst Dynamics， MNR， Key Laboratory of Karst Ecosystem and Treatment of Rocky Desertification， MNR， Institute of Karst Geology， Chinese Academy of Geological Sciences， Guilin 541004， Guangxi， China ）

Abstract：? ?Petrocodon Hance （Gesneriaceae） consists of 41 species and is mainly distributed in the limestone region of South China. So far， the chromosome numbers of only four species have been reported， with the rest species in the genus remained uninvestigated yet. Furthermore， the evolutionary history of the chromosome number and ploidy in Petrocodon as well as in its sister genus Primulina remain unexplored， and particularly whether it affected their diversifications into extant species diversity remain unknown. In this study， the root tip cells of four species （including one variety） of Petrocodon （i.e. Petrocodon dealbatus var. dealbatus， Petrocodon dealbatus var. denticulatus， Petrocodon longangensis and Petrocodon sp.） which were generated by hydroponic culture method for the cutting leaves， were used for the chromosome experiments. First， the effects of various experimental treating conditions on the quality of chromosome squashing were explored and the chromosome numbers were counted. Then， the evolutionary history of chromosome numbers in Petrocodon and Primulina were traced based on the molecular phylogenetic tree， and whether the diversifications of the species diversity for the two genera were impacted by changes of the chromosome number or especially the ploidy or not was discussed. The results were as follows： （1） The root tip of 1-1.5 cm length， pretreatment for 5 h with 0.002 mol·L-1 8-hydroxyquinoline solution and dissociation for 4 min was a suitable chromosome preparation condition. （2） All the four species （including one variety） investigated were diploid and the chromosome numbers were the same （2n=2x=36）. （3） Although the reconstruction of the ancestral state of the chromosome number of Petrocodon and Primulina failed to give any resolution for the most recent common ancestors of the two genera （generic stem node） and each of the genera （generic crown nodes）， the chromosome number of Petrocodon and Primulina was highly conserved with most taxa possessing 2n=2x=36， except for the ploidy or chromosome number changes in few species， suggesting the disproportional diversification of species diversity between Petrocodon and Primulina was not correlated to the change of the chromosome number or ploidy. This study provides a reference for the chromosome preparation of Petrocodon and its allies， and also provides basic data and implications for further research on the classification， systematic evolution and speciation of Petrocodon.

Key words：? ?Petrocodon， chromosome numbers， genome ploidy， species diversification

石山苣苔屬（Petrocodon Hance）于1883年建立，隸屬于苦苣苔科（Gesneriaceae）長蒴苣苔族（Trib. Didymocarpeae Endl.）。該屬早期僅包含1種和1變種，即石山苣苔（Petrocodon dealbatus）和齒緣石山苣苔（Petrocodon dealbatus var. denticulatus）（Wang et al.，1998;李振宇和王印政，2005;韋毅剛等，2010）。近年來，通過分子系統(tǒng)發(fā)育研究，結合進一步的形態(tài)特征比較，對石山苣苔屬進行了分類修訂：原石山苣苔屬（Petrocodon Hance）、朱紅苣苔屬（Calcareoboea Wu ex Li）、方鼎苣苔屬（Paralagarosolen Wei）、世緯苣苔屬（Tengia Chun）、長檐苣苔屬（Dolicholoma Fang & Wang）和細筒苣苔屬（Lagarosolen Wang）的所有種，以及長蒴苣苔屬（Didymocarpus Wallich） [柔毛長蒴苣苔（D. mollifolius）、綿毛長蒴苣苔（D. niveolanosus）和東南長蒴苣苔（D. hancei）]、文采苣苔屬（Wentsaiboea Fang & Qin） [天等文采苣苔（W. tiandengensis）]和報春苣苔屬（Primulina Hance） [廣西報春苣苔（Primulina guangxiensis）]的部分種類都被并入廣義石山苣苔屬內（Weber et al.，2011;Xu et al.，2014）。這一分類修訂，加之隨后該屬一些新物種的不斷發(fā)表 （Chen et al.，2014;Hong et al.，2014;Xu et al.，2014;Yu et al.，2015;Li & Wang，2015;Middleton et al.，2015;Guo et al.，2016;Lu et al.，2017;Cen et al.，2017;Zhang et al.，2018;陳力等，2019;Zhang et al.，2019;Li et al.，2019;蘇蘭英等，2019），使得現今廣義石山苣苔 屬增加，約41種（含1變種）（http：//www.IPNI.org）。

廣義石山苣苔屬因并入了多個其他屬的部分或全部種類而使其形態(tài)尤其花部形態(tài)復雜多樣，可能是舊世界苦苣苔科植物花形態(tài)最為復雜多樣的屬之一（Weber et al.，2011）。盧永彬等（2017）對廣義石山苣苔屬的形態(tài)演化研究表明，多數花部形態(tài)特征尤其以往屬的分類界定特征，在演化過程中變化頻繁且發(fā)生了高度同塑性演化（homoplastic evolution），是導致傳統(tǒng)形態(tài)分類不自然的關鍵因素。雖然新界定的石山苣苔屬在分子系統(tǒng)樹上為單系類群，但是它的一些物種反而在形態(tài)上與其姐妹屬報春苣苔屬的一些物種最為相似（如Petrocodon tiandenensis與Primulina renifolia;Petrocodon guangxiensis與Primulina tabacum）。目前，還未能找到石山苣苔屬與其姐妹屬報春苣苔屬各自的共衍征（synapomorphy）能夠用于確鑿地區(qū)分此兩屬。另外，廣義石山苣苔屬約41種，而作為它的姐妹屬報春苣苔屬有約233種（http：//www.IPNI.org），導致兩姐妹屬間物種多樣性極不對稱的原因亦缺乏研究。這些問題的回答，不僅要進一步對廣義石山苣苔屬植物形態(tài)、分子系統(tǒng)發(fā)育開展更廣泛、更深入的研究，而且更需要從其他層面或角度開展研究。

染色體是遺傳信息的載體，通過染色體數目、倍性和核型等指標，可分析并揭示染色體結構差異及遺傳多樣性，為植物的分類和系統(tǒng)演化提供重要依據。目前已報道了報春苣苔屬百余種（約占總種數三分之二）植物的染色體數目，而石山苣苔屬植物染色體數目和倍性的研究卻寥寥無幾，僅見Petrocodon hancei（2n=20）、Petrocodon jingxiensis、Petrocodon hechiensis和Petrocodon niveolanosus（2n=36）四種石山苣苔的染色體數目有所報道（曹麗敏等，2003;劉瑞瑞等，2014）。由此可見，石山苣苔屬不僅絕大多數物種的染色體數目和倍性尚不清楚，而且染色體數目可能存在很大差別，仍需對更多石山苣苔屬植物的染色體數目進行研究。與其他許多苦苣苔科植物類似，石山苣苔屬為小型染色體，染色體制片不易，需探索不同的實驗條件對染色體制片效果的影響（MOller & Kiehn，2004;劉瑞瑞，2013）。因此，本研究在多種不同的實驗條件下對四種（含一變種）石山苣苔屬植物進行染色體制片和觀察，探索石山苣苔屬染色體制片的適宜條件并對染色體計數，重建染色體數目和倍性在該屬及其姐妹屬報春苣苔屬中的演變歷史，以及探討其是否與兩屬物種多樣性分化存在關聯(lián)，旨在為石山苣苔屬植物及其近緣類群的染色體制備方法提供參考，更為進一步研究該類群的分類、系統(tǒng)演化和物種形成等提供細胞學方面的證據和啟示。

1 材料與方法

1.1 材料

四種（含一變種）石山苣苔屬植物（表1），栽培于廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所種質資源圃中。

1.2 實驗方法

1.2.1 石山苣苔屬染色體制片條件優(yōu)化

1.2.1.1 取材 取四種（含一變種）石山苣苔屬植物的健康葉片，室溫下用蒸餾水培養(yǎng)20 d左右，2～3 d換一次水，待葉片生根。對生長良好的葉片植物根尖，在8：30—9：00、20：00—20：30兩個時間段內，分別對0.5、1～1.5、2～4 cm的根尖進行取材。

1.2.1.2 預處理 設置三種預處理方法：① 0.05%秋水仙素溶液，預處理4 h;② 0 ℃冰水混合物，預處理24 h;③ 0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液，預處理5 h。

1.2.1.3 固定 將處理后的根尖材料用蒸餾水清洗3～5次，轉到卡諾固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）中，在4 ℃下固定過夜。

1.2.1.4 解離 將固定好的根尖用蒸餾水清洗3～5次，轉到解離液（1 mol·L-1 HCl∶45%冰醋酸=2∶1）中，在60 ℃干式恒溫加熱器中分別解離2、4、6 min。

1.2.1.5 染色與壓片 將解離后的根尖用蒸餾水充分清洗后置于載玻片上，用刀片切取前端乳白色的分生區(qū)，滴加少量改良卡寶品紅染色液，染色1～2 min后進行常規(guī)壓片。

1.2.1.6 鏡檢及染色體計數 將制好的片子放在顯微鏡Lecia2500下檢測，挑選具有有絲分裂中期分裂相、染色體分散和平展良好的細胞于100倍油鏡下進行觀察和拍照。染色體計數方法參照李懋學和陳瑞陽（1985）的植物核型分析標準。

1.2.2 石山苣苔屬和報春苣苔屬染色體數目的祖先狀態(tài)重建? 通過查閱文獻及染色體數目查詢網站Chromosome Counts Database （CCDB）（http：//ccdb.tau.ac.il/about/ #IPCN online），對石山苣苔屬和報春苣苔屬染色體數目已報道的數據進行收集和整理，并結合本研究報道的四種（含一變種）石山苣苔屬植物染色體數目，將染色體數目進行編碼，在核糖體ITS系統(tǒng)發(fā)育樹上，用Mesquite軟件（Maddison & Maddison，2018）中的MP簡約法，通過Trace Character History選項對石山苣苔屬和報春苣苔屬物種進行染色體數目祖先狀態(tài)重建，從而追溯染色體數目的演化歷史。

核糖體ITS系統(tǒng)發(fā)育樹的構建：下載NCBI數據庫中石山苣苔屬和報春苣苔屬物種的ITS序列，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），堿基替換模型設定為GTRGAMMA（General time reversible model of nucleotide subistution with the gamma model of rate heterogeneity），用隨機樹作為起始樹，矩陣重復抽樣1 000次計算支持率（bootstrap support）。具體運行參數設置為raxmlHPC-f a-x 123-p 334-# 1000-s a.phy-m GTRGAMMA-n b。

2 結果與分析

2.1 石山苣苔屬染色體標本制備方法的優(yōu)化

2.1.1 取樣時間和根尖長度的優(yōu)化? 比較石山苣苔屬植物根尖不同取樣時間、取樣長度獲得的中期分裂相細胞，分析石山苣苔屬根尖細胞分裂高峰期，結果見表2。由表2可知，8：30—9：00是根尖細胞分裂旺盛的時間，染色體分離效果良好;20：00—20：30取樣則分離效果較差。從圖1可以看出，根尖長為1～1.5 cm時，分裂最旺盛，染色體清晰可見且處于中期分裂相的細胞最多，即分離效果最好;根尖長為0.5 cm時，分裂還不夠旺盛，觀察到的細胞偏少且形態(tài)不夠好，效果一般;根尖長為2～4 cm時，纖維過多，導致分離效果差。

2.1.2 預處理的優(yōu)化? 采用三種方法進行預處理的優(yōu)化。表2和圖2結果表明，0.05 %秋水仙素溶液預處理4 h后，根尖染色體不夠濃縮，形態(tài)不好，有拖帶現象;0 ℃冰水預處理24 h后，染色體制片效果因物種而異，部分物種（如弄崗石山苣苔）不適用，有拖帶現象，分離效果一般;0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉水溶液預處理5 h后，制片效果相對最好，染色體呈分散狀態(tài)，該方法適用于石山苣苔屬植物的根尖預處理。

2.1.3 解離時間的優(yōu)化? 比較不同酸解時間下染色體分離的效果。表2和圖3結果表明，解離2 min時，時間稍微偏短，染色體相對聚集，不夠分散，分離效果一般;解離4 min時，染色體相對分散，分離效果良好;解離6 min時，時間偏長，染色不如2 min和4 min時深，有的細胞破裂，染色體黏連，分離效果差。

2.2 石山苣苔屬染色體數目和倍性分析

根據石山苣苔屬染色體標本制備方法的優(yōu)化結果，制備了四種（含一變種）石山苣苔屬植物的染色體圖（圖4）。從圖4可以看出，它們的染色體數目一致，均為二倍體2n=2x=36（表3）。

2.3 石山苣苔屬和報春苣苔屬染色體數目的演變

根據石山苣苔屬和報春苣苔屬染色體數目的祖先狀態(tài)重建結果（圖5），還不能確定石山苣苔屬祖先、報春苣苔屬祖先和兩屬的最近共同祖先的染色體條數。在石山苣苔屬內部，出現一次染色體數目由2n=36到2n=20的演化。在報春苣苔屬的內部，雖然祖先狀態(tài)重建未能直接確定唯一在弄崗報春苣苔中出現的2n=72與其余所有2n=36之間的演化方向，但根據常理判斷，前者顯然由后者經歷基因組加倍形成。

3 討論與結論

3.1 石山苣苔屬染色體標本制備條件的優(yōu)化

石山苣苔屬植物為小型染色體，染色體較小的植物根尖組織壓片后染色體不易分散且難以觀察到清晰的染色體形態(tài)， 因此對其取樣時間和根尖長度、預處理方法及酸解時間進行了優(yōu)化研究。

染色體制片若要獲得較多的分裂相，需保證植物細胞處于旺盛的有絲分裂期，因此需要找到最佳的取材時間點，同時控制好根尖長度。前人研究表明，大多數植物在8：00—11：00內的某個時間段內取材，中期分裂相較多，染色體制片成功率較高，如橡膠草（Taraxacum kok-saghyz）（楊玉雙等，2017）、白刺花（Sophora davidii）（雷文英等，2017）、黃花芥藍 [yellow-flower Chinese kale（Brassica alboglabra）]（夏雪等，2016）等。本研究中，石山苣苔屬植物取材時間為8：30—9：00時，中期分裂相較多，這與大多數植物常規(guī)取材時間一致。此外，根尖長度對分裂相的多少也有明顯影響。前人研究表明，北柴胡（Bupleurum chinense）的根尖長度為0.5～1 cm時，中期分裂相較多（何倚漣等，2018）;青花菜（Brassica oleracea var. italica）的根尖長度為1.3～1.5 cm時，中期分裂相最多（張紅梅等，2009）;不結球白菜（B. campestris ssp. chinensis）的根尖長度為1～2 cm時，中期分裂相數目較多（鄭金雙等，2011）。本研究結果表明，石山苣苔屬根尖長度為1～1.5 cm時，中期分裂相較多。

預處理是染色體制片過程的關鍵環(huán)節(jié)，由于植物自身存在的差異，在實驗過程中預處理液及預處理時間也存在著差別（劉丹等，2015）。本研究對比不同預處理液的制片效果后認為，四種（含一變種）石山苣苔屬植物采用0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液作為預處理液制片效果最好。這與李 懋學和張贊平（1996）提出的多種小染色體植物如大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa）等宜用0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液作預處理液是一致的。韓杰等（2018）研究染色體非常小的薄殼山核桃（Carya illinoinensis ）時認為，用0.01%的秋水仙素溶液進行預處理效果較好，而用0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液效果較差;但本研究中，用0.05%的秋水仙素溶液作為預處理液效果較差，而用0.002 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液效果較好。這可能是由于秋水仙素濃度的高低或不同植物特性導致的預處理效果不同。本研究中，0 ℃冰水作為預處理液對部分物種適用，以往測定的三種石山苣苔屬植物染色體數目也是采用0 ℃冰水作為預處理液（劉瑞瑞等，2014）。但是，本研究中弄崗石山苣苔相對于其他物種，不宜采用0 ℃冰水進行預處理。

酸解過程中，時間過短，細胞壁難以被破壞，染色體不易分散;時間過長，容易造成染色體斷裂或缺失。因此，在實驗過程中要準確地控制好各種材料的解離時間。本研究中，四種（含一變種）石山苣苔屬植物適宜的解離時間為4 min，這與以往報春苣苔屬和石山苣苔屬染色體酸解時間3 min較接近（Liu et al.，2012;劉瑞瑞等，2014）。

總的來說，不同物種之間的制片方法存在差異，需要通過多次實驗并結合植株本身特性才能得到最佳的染色體制片方案。本研究對石山苣苔屬植物葉片根尖染色體制片技術進行了初步探索，可為石山苣苔屬及其近緣屬植物的染色體制片提供借鑒。

3.2 石山苣苔屬染色體數目和倍性分析

本文首次對該四種（含一變種）石山苣苔屬植物的染色體數目開展研究。四種（含一變種）植物染色體數目一致，均為二倍體（2n=2x=36），結合已報道的Petrocodon hancei染色體數目2n=20（曹麗敏等，2003）可知，目前該屬染色體數目有2n=20、2n=36兩種類型，染色體基數有x=10、x=18兩種類型。在研究的四個物種（含一變種）中，石山苣苔未定名種的ITS、trnL-F序列與Petrocodon hancei一些個體的序列無差異，在分子系統(tǒng)樹上表現為與Petrocodon hancei的一些個體聚在一起。但是，石山苣苔未定名種與Petrocodon hancei有較明顯的形態(tài)差別，如葉片形狀和大小、花冠顏色和下唇內側條紋等都有所差別，推測其可作為石山苣苔屬的變種。已報道的Petrocodon hancei的染色體數目為2n=20（曹麗敏等，2003），但與其親緣關系最近的石山苣苔未定名種染色體數目為2n=36，其他已知的石山苣苔屬植物染色體數目也均為2n=36。因此，在今后的研究中需進一步驗證Petrocodon hancei的染色體數目，同時需要對更多的石山苣苔屬植物的染色體數目進行研究，從而明確該屬物種的染色體數目類型。

由對石山苣苔屬和其姐妹屬報春苣苔屬的染色體數目和倍性分析可知，石山苣苔屬除Petrocodon hancei以外，其余物種染色體數目一致，均為二倍體;報春苣苔屬除弄崗報春苣苔有四倍體個體以外，其余物種染色體數目和倍性與石山苣苔屬一致（Liu et al.，2012;劉瑞瑞等，2014;Kang et al.，2014）。染色體數目、倍性的一致性印證了兩屬間存在很近的親緣關系，這與分子系統(tǒng)發(fā)育的研究結果相一致。

3.3 石山苣苔屬和報春苣苔屬染色體數目的演化與兩屬間物種多樣性分化

對石山苣苔屬和報春苣苔屬染色體數目已報道的數據進行收集和整理，從在分子系統(tǒng)樹上追蹤染色體數目的變化可以看出，雖然兩屬之間及兩屬各自的最近共同祖先染色體數目都不明確，但除了個別物種染色體數目有變化外，兩屬的染色體數目高度一致（均為2n=36），且已知染色體數目的物種在分子系統(tǒng)樹各分支上均有代表，從而推測兩屬之間、兩屬各自的最近共同祖先及兩屬內部各枝系的祖先染色體數目為2n=36的可能性最大。

多倍體植物在自然界中普遍存在，多倍化是植物演化和物種形成過程中最重要的細胞遺傳學機制之一（Soltis & Soltis，1999）。前人研究表明，多倍化可能顯著增加物種的多樣性，增強植株對環(huán)境的適應性（Van de Peer et al.，2009;Soltis et al.，2015）。反之，前人也有研究表明，多倍化能減慢物種分化進而呈現較低多樣性（Mayrose et al.，2011）。在物種數量上，石山苣苔屬約41種，而報春苣苔屬有200余種，兩屬物種數量相差5～6倍。報春苣苔屬植物適應性強，不同種類所適應的生境有時截然不同，多數種類生長在陰濕的林下石壁或巖溶洞穴中，大都具有扁平葉;另一些種類則適應了干旱、高溫環(huán)境，生長在毫無遮陰、陽光直射的裸露巖石石縫或巖石表面上，葉片變?yōu)榉屎?、多汁的棒狀，與生長在荒漠中的仙人掌科或景天科的多肉植物接近（王莉芳等，2009;韋毅剛等，2010）。雖然Christie et al.（2012）推斷廣義報春苣苔屬的染色體數目2n=36起初可能是由祖先具有染色體數目為2n=18直接加倍而來，但是報春苣苔屬和石山苣苔屬植物中除了一個多倍體外，其他都沒有出現多倍化且染色體數目極其穩(wěn)定，僅個別物種中存在基因組加倍個體。顯然，兩屬物種多樣性差異及物種環(huán)境適應性轉變與基因組加倍事件無關。

植物在演化過程中，除了多倍化以外，還出現了染色體的斷裂或融合，使得細胞丟失或增加一條或若干條染色體，即非整倍化（Olson & Gorelick，2011）。在石山苣苔屬和報春苣苔屬中，除了個別物種外，幾乎所有種類染色體條數高度一致（2n=36），因此多倍化和非整倍化在兩姐妹屬植物演化和物種形成過程中的作用很小。但是，值得關注的是，Petrocodon hancei的染色體數目2n=20與其他2n=36（72）不呈倍數關系。如果該種染色體數目確實無誤，那么其演變機制以及染色體數目的減少對植物適應性有何意義，值得深入研究。石山苣苔屬和報春苣苔屬有的物種具有1個或2個隨體，有的物種并無隨體（劉瑞瑞，2013）。染色體結構是否存在其他變化，如染色體重排、互相轉座和臂間倒位等，以及它們在石山苣苔屬和報春苣苔屬植物物種分化過程中是否起作用，還有待于進一步研究。

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（ 責任編輯 蔣巧媛 ）