康健 許承明 張薇 柏銀蘭 韓文東 孫志平 徐志凱 王麗梅

[摘要] 目的 建立結(jié)核分枝桿菌（Mtb）H37Rv株急性感染豚鼠模型的方法。 方法 18只豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：空白劑量組、皮下高劑量組、皮下低劑量組、滴鼻高劑量組、滴鼻中劑量組和滴鼻低劑量組，每組3只。皮下高、低劑量組采用腹股溝皮下注射的方式分別感染2×106 CFU/200 μL和1×106 CFU/200 μL的Mtb H37Rv PBS懸液。滴鼻高、中、低劑量組采用滴鼻的方式分別感染5×105、5×104 CFU/50 μL和5×103 CFU/50 μL的Mtb H37Rv PBS懸液。感染4周后，檢測(cè)各組豚鼠的肺脾荷菌數(shù)和組織病理學(xué)改變情況。 結(jié)果 感染4周后，皮下高劑量組的肺、脾Mtb荷菌數(shù)均高于皮下低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。感染4周后，皮下高劑量組的肺Mtb荷菌數(shù)高于滴鼻高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。感染4周后，皮下高、低劑量組和滴鼻高劑量組豚鼠的肺組織有明顯充血，肺泡壁間隔增厚，滴鼻中、低劑量組豚鼠的肺組織僅有輕微充血。感染4周后，各組豚鼠脾組織病理變化不明顯。 結(jié)論 采用腹股溝皮下感染的方式成功建立H37Rv株急性感染豚鼠模型，為結(jié)核病新型疫苗和藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌;豚鼠;動(dòng)物模型;急性感染

[中圖分類號(hào)] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）10（c）-0020-04

Study on guinea pig model of acute infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain

KANG Jian1? ?XU Chengming1? ?ZHANG Wei2? ?BAI? Yinlan1? ?HAN Wendong3? ?SUN Zhiping3? ?XU Zhikai1? ?WANG Limei1

1.Department of Microbiology and Pathogenic Biology， Air Force Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an? ?710032， China; 2.Department of Pediatric， Tangdu Hospital， Air Force Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an? ?710032， China; 3.the Third Level Biosafety Laborator， Fudan University， Shanghai? ?200032， China

[Abstract] Objective To establish a guinea pig model of acute infection with Mycobacterium tuberculosis （Mtb） H37Rv strain. Methods Eighteen guinea pigs were divided into six groups： blank-dose group， subcutaneous high-dose group， subcutaneous low-dose group， intranasal high-dose group， intranasal middle-dose group and intranasal low-dose group according to random number table method. There were three guinea pigs in each group. Subcutaneous high-dose group and subcutaneous low-dose group was infected with Mtb H37Rv PBS suspension of 2×106 CFU/200 μL and 1×106 CFU/200 μL respectively. Intranasal high-dose group， intranasal middle-dose group and intranasal low-dose group was infected with Mtb H37Rv PBS suspension of 5×105， 5×104 CFU/50 μL and 5×103 CFU/50 μL respectively. After four weeks of infection， the number of bacteria and histopathological changes of lung and spleen in each group were detected. Results After four weeks of infection， the number of Mtb in lung and spleen of subcutaneous high-dose group was higher than that of subcutaneous low-dose group （P < 0.05）. After four weeks of infection， the number of Mtb in lung of subcutaneous high-dose group was higher than that of intranasal high-dose group （P < 0.05）. After four weeks of infection， the lung tissues of guinea pigs in subcutaneous high-dose group， subcutaneous low-dose group and intranasal high-dose group were obviously congested and the alveolar wall were thickened; the lung tissue of guinea pigs in intranasal middle-dose group and intranasal low-dose group had only slight hyperemia. After four weeks of infection， the pathological changes of spleen tissue in each group were not obvious. Conclusion The guinea pig model of acute infection with Mtb H37Rv is established successfully， which provides the research foundation for novel tuberculosis vaccines and new drugs.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis; Guinea pig; Animal model; Acute infection

目前，結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染所致的結(jié)核?。═B）仍是危害全球人類健康的重大傳染病。目前全球每年約有150萬人死于TB，新發(fā)TB患者約1000萬例[1]。TB的致病機(jī)制、診斷、新型藥物和疫苗研究成為當(dāng)前世界各國重要的科學(xué)研究課題[2]。動(dòng)物模型是研究人類疾病的重要工具，TB動(dòng)物模型研究種類較多，包括小鼠、豚鼠、兔子、猴子和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物等，各種動(dòng)物各有優(yōu)缺點(diǎn)，能夠模擬人類TB的不同特點(diǎn)[3-4]。豚鼠對(duì)Mtb高度敏感，感染后在肺部病理學(xué)上的特征與人類TB肺部特征表現(xiàn)較為相似，能夠形成典型的肉芽腫炎性結(jié)構(gòu)，并可發(fā)展為干酪樣壞死，是建立TB動(dòng)物模型的較佳選擇[5-6]。Mtb感染豚鼠的方法較為普遍的是采用氣溶膠和腹股溝皮下注射兩種方法[7-9]。然而，由于目前我國尚缺乏能夠進(jìn)行Mtb氣溶膠感染動(dòng)物的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，但為了能更好地模擬Mtb自然感染的過程，本研究選擇腹股溝皮下注射和滴鼻感染兩種方式，采用Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，通過不同感染劑量和感染途徑探索建立H37Rv急性感染豚鼠模型的制備方法，以期為TB新型疫苗和藥物的研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株? Mtb H37Rv株來自陜西省結(jié)核病防治研究所，并在本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2 培養(yǎng)基? Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基、7H10固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑（OADC）均購自BD公司。

1.1.3 生化試劑? 4%多聚甲醛（pH 7.4），0.4% PBS-Tween 80，L-抗壞血酸均購于上海生工，戊巴比妥鈉購于西安科昊公司。

1.1.4 主要儀器? 生物安全柜CELLGARD475（NuAire公司），換籠柜NU-602（NuAire公司），震蕩破碎器MSD 220V（Densply公司），-80℃超低溫冰箱（Sanyo公司），恒溫培養(yǎng)箱（上?？等A生化儀器制造有限公司）。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? SPF級(jí)Hartley雌性豚鼠18只，6周齡，體重200～300 g，購于中國食品藥品檢定研究所[許可證號(hào)SCXK（京）2009-0017]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在復(fù)旦大學(xué)三級(jí)（BSL-3）生物安全實(shí)驗(yàn)室（認(rèn)可編號(hào)：CNAS BL0021，衛(wèi)：BSL3-010）中進(jìn)行。豚鼠在獨(dú)立通風(fēng)籠具中飼養(yǎng)，自由取食飲水，飲水中添加6 mg/L濃度的L-抗壞血酸。每日記錄觀察豚鼠活動(dòng)情況，記錄體重一次。喂養(yǎng)動(dòng)物房間通風(fēng)良好，按晝夜節(jié)律采光12 h，保持室溫18～22℃、濕度40%～70%。實(shí)驗(yàn)過程中供給專用豚鼠飼料及含有L-抗壞血酸飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 Mtb菌液制備? Mtb H37Rv株保存菌種復(fù)蘇后接種于7H9液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)3周，將培養(yǎng)后的菌液制備成分散的菌懸液后，1 mL分裝，-80℃保存，使用前平板法做細(xì)菌CFU計(jì)數(shù)。

1.2.2 動(dòng)物分組和感染? 將豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，分別為空白劑量組、皮下高劑量組（2×106 CFU/200 μL）、皮下低劑量組（1×106 CFU/200 μL）、滴鼻高劑量組（5×105 CFU/50 μL）、滴鼻中劑量組（5×104 CFU/50 μL）和滴鼻低劑量組（5×103 CFU/50 μL），各組3只豚鼠[10-11]。將-80℃保存的Mtb H37Rv菌懸液在室溫下自然溶解，按已知活菌數(shù)稀釋濃度至各組應(yīng)用濃度。各濃度菌懸液在使用前短暫超聲分散菌體。皮下高、低劑量組采用腹股溝皮下注射的方式分別感染2×106 CFU/200 μL和1×106 CFU/200 μL的Mtb H37Rv PBS懸液。滴鼻高、中、低劑量組采用滴鼻的方式分別感染5×105、5×104 CFU/50 μL和5×103 CFU/50 μL的Mtb H37Rv PBS懸液。滴鼻組豚鼠首先經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉250 μL/只麻醉后，仰臥，使其鼻孔向上，用移液器向雙側(cè)鼻孔各滴入25 μL菌液，保持豚鼠體位約1 min，使液體流入下呼吸道。

1.2.3 動(dòng)物解剖和標(biāo)本處理? 感染后4周，各組豚鼠用3%戊巴比妥鈉1.0 mL腹腔注射麻醉后解剖，無菌取豚鼠脾、肺，PBS沖洗，取脾和左肺尖部少量組織放入4%多聚甲醛固定液中保存，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片及脫蠟等步驟后進(jìn)行HE染色，觀察臟器的組織病理改變情況。剩余脾肺組織分別置于細(xì)胞濾網(wǎng)上，加入10 mL的PBS，注射器針芯研磨，收集細(xì)胞懸液至15 mL離心管，混勻后做10-1、10-2、10-3系列稀釋。分別取各稀釋度細(xì)胞懸液100 μL涂布于7H10平板上，每個(gè)稀釋度設(shè)兩個(gè)復(fù)板，置于37℃孵箱培養(yǎng)3周后計(jì)數(shù)菌落CFU。按照下列公式計(jì)算臟器荷菌量（lgCFU）=log10[平板CFU數(shù)×計(jì)數(shù)部分臟器比重（全臟器重量/計(jì)數(shù)部分臟器重量）×研磨液稀釋倍數(shù)（研磨液體積/涂布液體積）]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠感染4周后肺、脾Mtb荷菌數(shù)比較

感染4周后，皮下高劑量組的肺、脾Mtb荷菌數(shù)均高于皮下低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。感染4周后，皮下高劑量組的肺Mtb荷菌數(shù)高于滴鼻高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組豚鼠肺、脾組織病理學(xué)結(jié)果

感染4周后，皮下高、低劑量組和滴鼻高劑量組豚鼠的肺組織有明顯充血，肺泡壁間隔增厚，滴鼻中、低劑量組豚鼠的肺組織僅有輕微充血。感染4周后，各組豚鼠脾組織病理變化不明顯。見圖1。

3 討論

動(dòng)物模型的建立涉及多方面因素的影響，如動(dòng)物品種、感染菌毒力、感染劑量、感染途徑、感染時(shí)間以及操作者的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)等[12-13]。Mtb H37Rv株為Mtb的標(biāo)準(zhǔn)毒株，與其他Mtb毒株比較，用Mtb H37Rv株建立豚鼠Mtb感染模型，有利于模型在不同實(shí)驗(yàn)室間的重復(fù)性和一致性，并有利于TB新型藥物和疫苗在動(dòng)物模型中的評(píng)價(jià)比較研究[14]。

臟器荷菌量和臟器病理改變是目前TB動(dòng)物模型的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[15-16]，尤其是對(duì)于豚鼠這類免疫檢測(cè)試劑相對(duì)較少的動(dòng)物。豚鼠是Mtb敏感動(dòng)物模型[17-19]，前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)皮下感染劑量較高時(shí)，豚鼠感染模型的死亡率較高，不利于后期TB疫苗和藥物的評(píng)價(jià)篩選（數(shù)據(jù)未發(fā)表），但當(dāng)感染劑量較低時(shí)，豚鼠脾肺的臟器荷菌量又較低，疾病進(jìn)程較慢，豚鼠飼養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，體型變大，也不利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。因此，為了建立Mtb H37Rv株急性感染豚鼠模型的方法，本研究設(shè)置了不同的感染劑量，經(jīng)皮下和滴鼻兩種途徑進(jìn)行感染，并在感染后4周對(duì)豚鼠的感染結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，豚鼠經(jīng)腹股溝皮下途徑感染，劑量為4×105 CFU時(shí)，其脾、肺組織中的Mtb會(huì)發(fā)生顯著增殖，且肺組織會(huì)發(fā)生明顯的病理學(xué)改變，提示Mtb急性感染豚鼠模型制備成功。皮下低劑量組（劑量為4×105 CFU）感染豚鼠的脾肺中雖然也有一定的Mtb荷菌量，但數(shù)量較低，Mtb在組織中并未發(fā)生明顯增殖。不過該結(jié)果也提示，采用皮下方式感染，豚鼠的臟器荷菌量與初始感染劑量能呈現(xiàn)較好的一致性。

與皮下注射感染的方式比較，經(jīng)滴鼻途徑的感染能更好地模擬Mtb自然感染[20-21]。本研究設(shè)置了高（5×105）、中（5×104）、低（5×103）三個(gè)劑量進(jìn)行滴鼻感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)感染劑量達(dá)到5×105 CFU時(shí)，才可在豚鼠的肺臟中檢測(cè)到少量的Mtb荷菌數(shù)，但脾組織中的Mtb荷菌數(shù)仍為0，提示豚鼠的呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)Mtb具有一定的抵抗。雖然本研究尚未建立H37Rv株經(jīng)滴鼻方式急性感染豚鼠的合適劑量，然而實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)滴鼻方式感染豚鼠的個(gè)體差異較大，一致性較差，但經(jīng)滴鼻方式感染，Mtb主要侵入豚鼠的肺部，較皮下感染能更好地模擬Mtb的自然感染。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，采用皮下感染方式建立的豚鼠動(dòng)物模型重復(fù)性和一致性較好。采用滴鼻方式感染豚鼠，雖然豚鼠感染個(gè)體的一致性較差，但能較好地模擬Mtb自然感染。因此，在制備Mtb感染豚鼠模型時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的感染方式，如用于TB新型藥物和疫苗的保護(hù)效果評(píng)價(jià)，感染動(dòng)物模型的臟器荷菌量和病理學(xué)改變是關(guān)鍵的評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇腹股溝皮下感染的方式進(jìn)行動(dòng)物模型制備，有利于疫苗的評(píng)價(jià)篩選[22-23];而如果是進(jìn)行TB的致病機(jī)制和保護(hù)性免疫的機(jī)制研究，則動(dòng)物模型的感染途徑應(yīng)盡可能模擬Mtb的自然感染途徑，如滴鼻，不僅可以誘發(fā)呼吸道局部黏膜免疫，而且可以刺激全身系統(tǒng)性免疫[24-25]，有利于準(zhǔn)確反映疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制。

總之，本研究通過腹股溝皮下感染的方式成功建立了Mtb急性感染豚鼠的動(dòng)物模型，為TB新型疫苗和藥物的篩選評(píng)價(jià)提供了研究平臺(tái)。由于實(shí)驗(yàn)條件等的限制，本研究未進(jìn)一步探索通過滴鼻方式建立急性感染豚鼠動(dòng)物模型的方法，還有望今后的進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Global tuberculosis report 2017 [D/OL]. http：//www.who.int/tb/en/.

[2]? Gupta UD，Katoch VM. Animal models of tuberculosis [J]. Tuberculosis（Edinb），2005，85（5-6）：277-293.

[3]? Zhan L，Tang J，Sun M，et al. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine [J]. Front Microbiol，2017，8：717.

[4]? 師長(zhǎng)宏，徐志凱，范雄林.結(jié)核分枝桿菌感染的動(dòng)物模型[J].國外醫(yī)學(xué)：微生物學(xué)分冊(cè)，2004，27（4）：31-34.

[5]? Kashino SS，Napolitano DR，Skobe Z，et al. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection [J]. Microbes Infect，2008，10（14-15）：1469-1476.

[6]? Myllym？覿ki H，Niskanen M，Oksanen KE，et al. Animal models in tuberculosis research—where is the beef？ [J]. Expert Opin Drug Discov，2015，10（8）：871-883.

[7]? 黎友倫，王國治，羅永艾.結(jié)核分枝桿菌潛伏感染動(dòng)物模型及評(píng)價(jià)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（8）：552-554.

[8]? 肖和平.耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南（2009）[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33（7）：485-497.

[9]? 董江濤，張萬江.結(jié)核分枝桿菌感染小鼠動(dòng)物模型的建立及研究進(jìn)展[J].中國病原生物學(xué)雜志，2011，6（8）：621-623.

[10]? 盧錦標(biāo)，鄧海清，陳保文，等.結(jié)核分枝桿菌潛伏感染豚鼠模型的建立和驗(yàn)證[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2013，33（12）：900-905.

[11]? Zhang Y，Yew WW，Barer MR. Targeting persisters for tuberculosis control [J]. Antimicrob Agents Chemother，2012，56（5）：2223-2230.

[12]? Wang P，Wang L，Zhang W，et al. Immunotherapeutic efficacy of recombinant Mycobacterium smegmatis expressing Ag85B-ESAT6 fusion protein against persistent tuberculosis infection in mice [J]. Hum Vaccin Immunother，2013，10（1）：1-9.

[13]? Steven C，Derrick，Idalia M，et al. Immunogenicity and protective efficacy of novel Mycobacterium tuberculosis antigens [J]. Vaccine，2013，31（41）：4641-4646.

[14]? 張昊凌，張志勇.結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].微生物與感染，2012，7（3）：184-189.

[15]? 王應(yīng)輝，王洪海，曹健，等.潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型[J].中國感染控制雜志，2011，10（4）：312-315.

[16]? 王豫萍，王和.結(jié)核分枝桿菌穩(wěn)定L型致病性的研究[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2001，16（z1）：14-16.

[17]? 路延之，王麗梅，康健，等.結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2的安全性評(píng)價(jià)研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2016，32（11）：945-951.

[18]? 王平，王麗梅，張薇，等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重組恥垢分枝桿菌對(duì)小鼠的免疫原性研究[J].中國防癆雜志，2012，34（3）：145-149.

[19]? 寧喚喚，路延之，康健，等.分枝桿菌持續(xù)感染小鼠模型的建立及其特征分析[J].中國病原生物學(xué)雜志，2017， 12（3）：219-223.

[20]? 黎友倫，陳保文，徐苗，等.結(jié)核分枝桿菌潛伏感染豚鼠模型的建立[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33（9）：684-687.

[21]? 盧錦標(biāo)，楊蕾，蘇城，等.重組AEC/BC02疫苗聯(lián)合化療在豚鼠模型中的抗結(jié)核效果[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2018，38（6）：414-419.

[22]? 張曉東，王洪生.結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2012，38（3）：190-193.

[23]? 李定越，盧潤生，蔣紹雙.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[J].四川醫(yī)學(xué)，2003，24（7）：761-762.

[24]? Hernfndez-Pando R，Pavon L，Orozcoe H，et al. Correlation between the kinetics of Thl，Th2 cells and pathology in a murine model of experimental pulmonary tuberculosis [J]. Immunology，1996，89（1）：26-33.

[25]? Dorhoi A，Reece ST，Kaufmann SH. For better or forworse：the immune response against Myeobacterium tuberculosis balances pathology and protection [J]. Immunol Rev，2011，240（1）：235-251.

（收稿日期：2020-04-15）

[基金項(xiàng)目] “艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)（2012ZX10003008-007）。

通訊作者