朱雷 黃云 李洪浩

摘要：為明確不同濃度鈦離子對致病疫霉菌絲生長、孢子囊釋放游動孢子、游動孢子萌發(fā)和致病力等方面的影響，通過在含有不同濃度鈦離子的黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)致病疫霉，以及配置含不同濃度離子鈦的致病疫霉孢子懸浮液，分析離子鈦對致病疫霉生長和致病力的抑制效果。結(jié)果表明，16 μg/mL鈦離子處理對菌絲生長和孢子囊釋放游動孢子具有較強的抑制作用，平均抑制率分別為95.77%、99.04%，而32 μg/mL鈦離子處理對游動孢子萌發(fā)和致病力具有較強的抑制作用，平均抑制率分別為92.72%、91.11%。離子鈦對致病疫霉菌絲生長、孢子囊釋放游動孢子、游動孢子萌發(fā)和致病力等方面抑制效果與鈦離子濃度成正比，這為馬鈴薯晚疫病環(huán)境友好型藥劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：離子鈦;致病疫霉;生物活性;馬鈴薯晚疫病; 抑制作用

中圖分類號： S435.32? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0117-04

由致病疫霉[Phytophthora infestans （Mont.） de Bary]引起的馬鈴薯晚疫病是對馬鈴薯生產(chǎn)極具毀滅性的病害[1]。目前，馬鈴薯晚疫病仍以化學農(nóng)藥防治為主，由此導致的環(huán)境污染、糧食安全、病原菌抗藥性[2]等問題尤為突出。《到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》的提出進一步提升了環(huán)境友好型農(nóng)藥研發(fā)的重要性。鈦是地球表面分布較為廣泛的元素之一，對促進植物生長，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)有明顯的作用[3]。鈦元素通常以氧化物、硅酸鹽結(jié)合態(tài)或鈦鐵礦存在，難以被植物吸收利用[4]。而由鈦谷（天津）科技有限公司生產(chǎn)的離子鈦（titanium ion of variable valence with light energy，簡稱TIVL）中鈦元素以離子的形式存在，溶于水中，對多種細菌的生長具有抑制作用[5]。探討離子鈦對致病疫霉生物活性的影響，可以為研究其抑菌機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019年在四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室完成。1.1 試驗材料

1.1.1 供試試劑 離子鈦由中國科學院成都生物研究所提供，鈦離子母液濃度為4×103 μg/mL，用無菌水梯度稀釋到320、160、80、40、20、10 μg/mL備用。

1.1.2 供試菌株 馬鈴薯致病疫霉采自四川省、貴州省、云南省、湖北省和重慶市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，由四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所分離和保存，純化、保存54份馬鈴薯致病疫霉。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 黑麥蔗糖瓊脂（rye sucrose agar，簡稱RSA）培養(yǎng)基：60 g黑麥，8 g瓊脂，20 g蔗糖，蒸餾水定容至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病疫霉分離培養(yǎng) 對分別采自四川省、貴州省、云南省、湖北省和重慶市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯晚疫病病葉進行消毒處理，取病健部1 cm2葉片置于已消毒的新鮮馬鈴薯薯片下，將放置有病樣和薯片的培養(yǎng)皿置于18 ℃黑暗條件下，5 d后挑取薯片上菌絲于黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，繼續(xù)在18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.2 致病疫霉菌懸液的制備 取致病疫霉菌落邊緣1 cm2菌塊，置于經(jīng)消毒的新鮮馬鈴薯薯片下，于18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，挑取薯片上菌絲于無菌水中，振蕩后經(jīng)雙層紗布過濾，獲得致病疫霉孢子囊懸浮液，用血球計數(shù)板調(diào)整孢子囊濃度為 5×104個/mL。將致病疫霉孢子囊懸浮液置于6 ℃條件下3 h刺激孢子囊釋放游動孢子，獲得致病疫霉游動孢子懸浮液，并用血球計數(shù)板調(diào)整游動孢子濃度為1×105個/mL。

1.2.3 含鈦平板和含鈦菌懸液的制備 含鈦黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板的制備：在90 mm培養(yǎng)皿中分別加入160、80、40、20、10 μg/mL 離子鈦1.5 mL與 13.5 mL 黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，充分搖勻后冷凝，使離子鈦終濃度分別為16、8、4、2、1 μg/mL，以不含離子鈦的培養(yǎng)基為對照。

含離子鈦菌懸液的制備：在60 mm培養(yǎng)皿中先加入9 mL濃度為5×104個/mL的致病疫霉孢子囊懸浮液，再分別加入1 mL濃度為160、80、40、20、10 μg/mL 的含離子鈦溶液，以不含離子鈦的無菌水為對照，分別獲得離子鈦濃度為16、8、4、2、1、0 μg/mL 的致病疫霉孢子囊懸浮液10 mL;同樣，在60 mm培養(yǎng)皿中先加入9 mL濃度為1×105個/mL的致病疫霉游動孢子懸浮液，再分別加入1 mL濃度為320、160、80、40、20、10 μg/mL的含離子鈦溶液，以不含離子鈦的無菌水為對照，分別獲得離子鈦濃度為32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游動孢子懸浮液10 mL。

1.2.4 離子鈦對生物學特性的影響測定 致病疫霉菌絲生長：在含離子鈦16、8、4、2、1 μg/mL和不含離子鈦的黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板中央接種直徑為5 mm致病疫霉菌餅后，經(jīng)2 500 lx光照2 h，置于 18 ℃，黑暗條件下，每個處理重復3次，7 d后采用十字交叉法統(tǒng)計菌落直徑。平板菌落直徑用平均值±標準偏差表示，抑菌率=（對照組平均菌落生長直徑-處理組平均菌落生長直徑）/對照組平均菌落生長直徑×100%，以t檢驗分析組間差異，P<0.05 視為差異顯著，P<0.01視為差異極顯著。

致病疫霉游動孢子釋放：將含離子鈦 16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉孢子囊懸浮液經(jīng)2 500 lx光照2 h后，置于6 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)3 h，統(tǒng)計每20個致病疫霉孢子囊中游動孢子的釋放數(shù)，每個處理重復3次。

致病疫霉游動孢子萌發(fā)：將含離子鈦32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游動孢子懸浮液經(jīng) 2 500 lx 光照2 h后，置于18 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計每20個游動孢子的萌發(fā)數(shù)，每個處理重復3次。

致病疫霉致病力：將含離子鈦 32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游動孢子懸浮液接種于馬鈴薯組培苗離體葉片，每張葉片接種5 μL，每個處理15張葉片，重復3次，在18 ℃、光—暗條件為16 h—8 h 條件下培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計發(fā)病葉片數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，利用DPS v7.05進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子鈦對致病疫霉菌絲生長的抑制作用

由表1可知，各濃度鈦離子對致病疫霉菌絲生長的平均抑制率存在顯著差異，其中16 μg/mL 離子鈦處理對致病疫霉菌絲生長的平均抑制率最高，為95.77%。離子鈦對不同?。ㄊ校┲虏∫呙沟陌胱畲笮?yīng)濃度（EC50）差異較大，最高為15.007 3 μg/mL，最低為2396 8 μg/mL，平均EC50為5.3 321 μg/mL（表2）。

2.2 離子鈦對致病疫霉游動孢子釋放的影響

由圖1可知，致病疫霉孢子囊在鈦離子濃度為0、1、2、4、8、16 μg/mL時的游動孢子平均釋放率分別為74.05%、65.95%、62.14%、51.19%、3333%、0.71%。差異性分析結(jié)果表明，1 μg/mL 鈦離子試驗組的游動孢子釋放率與對照組（0 μg/mL）之間存在顯著性差異（P<0.05），而鈦離子濃度為2、4、8、16 μg/mL的游動孢子平均釋放率與對照組之間存在極顯著差異（P<0.01），其中，16 μg/mL的離子鈦對致病疫霉孢子囊游動孢子釋放有明顯的抑制作用，平均抑制率為99.04%。

2.3 離子鈦對致病疫霉游動孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，致病疫霉游動孢子在鈦離子濃度為0、1、2、4、8、16、32 μg/mL時的平均萌發(fā)率分別為91.67%、86.67%、71.67%、51.67%、36.67%、25.00%、6.67%。差異分析結(jié)果表明，含2、4、8、16、32 μg/mL 鈦離子的游動孢子平均萌發(fā)率與對照組（0 μg/mL）之間存在極顯著性差異（P<0.01），游動孢子萌發(fā)率隨鈦離子濃度的增加而下降，說明離子鈦對致病疫霉游動孢子萌發(fā)有一定的抑制作用，其中32 μg/mL離子鈦處理的平均抑制率最高，為9272%（圖2）。

2.4 離子鈦對致病疫霉致病力的影響

由圖3可知，致病疫霉游動孢子在鈦離子濃度為0、1、2、4、8、16、32 μg/mL時侵染馬鈴薯葉片，葉片平均發(fā)病率分別為100.00%、100.00%、10000%、100.00%、97.78%、84.44%、8.89%。差異性分析結(jié)果表明，試驗組16、32 μg/mL 離子鈦處理的葉片發(fā)病率與對照組（0 μg/mL）之間存在極顯著性差異（P<0.01），對致病疫霉致病力的平均抑制率分別為15.56%、91.11%。

3 結(jié)論與討論

我國作為全球第一大馬鈴薯生產(chǎn)國，為保證糧食安全，我國啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，馬鈴薯成為繼水稻、小麥、玉米之后的第四大主糧。而馬鈴薯晚疫病作為危害馬鈴薯生產(chǎn)的重要病害，每年造成數(shù)十億美元的損失，其防治措施主要是噴施化學農(nóng)藥[6-9]。糧食安全和生態(tài)保護上升為國家戰(zhàn)略，針對病蟲害的綠色防控技術(shù)應(yīng)用的呼聲愈發(fā)高漲，結(jié)合農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革，開發(fā)和使用高效低毒低殘留藥劑勢在必行。離子鈦利用鈦具有外層電子活躍、對光敏感且發(fā)生化合價跳躍的特性，在促進植物養(yǎng)分的吸收和運轉(zhuǎn)、提高植物體內(nèi)多種酶的活性、增加葉片中葉綠素的含量、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[10-11]的同時，還具有提高植物抗逆性[12]和抑制細菌生長[5]等方面的作用，有望成為環(huán)境友好型農(nóng)藥。

致病疫霉是寄生性極強的兼性寄生菌，主要以游動孢子形成的休止孢產(chǎn)生芽管，自氣孔或表皮直接侵入馬鈴薯塊莖和葉片。本研究中離子鈦對致病疫霉菌絲生長、孢子囊釋放游動孢子、游動孢子萌發(fā)和致病力具有一定的抑制作用，其中32 μg/mL的離子鈦處理對游動孢子萌發(fā)和致病力具有較強的抑制作用，而16 μg/mL的離子鈦處理對致病疫霉菌絲生長和孢子囊釋放游動孢子具有較強的抑制作用，但對致病疫霉致病力的平均抑制率較低，僅為1556%，這與致病疫霉致病力強有關(guān)，即使游動孢子濃度為1個/μL，仍能成功侵染葉片。同時，經(jīng)400倍光學顯微鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)32 μg/mL的離子鈦處理對菌絲生長端、孢子囊和游動孢子的形態(tài)產(chǎn)生明顯影響。

目前，對離子鈦的抑菌機制尚未見報道，但研究表明與離子鈦相關(guān)的TiO2對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌及單細胞藻類均具有良好的殺滅效果[13]，推測離子鈦主要是通過破壞細胞壁和細胞膜的完整性、干擾代謝途徑、抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成等方面體現(xiàn)抑菌作用[5]。鈦作為一個變價元素，在太陽光的作用下，其化合價可在四價和三價間反復變化，使鈦具有較強的氧化還原能力，參與植物光合作用、生物固氮等重要生化過程的電子傳遞[7]。此外，離子鈦對環(huán)境和生物友好，探討離子鈦對致病疫霉生物活性的影響，為進一步研究其抑菌機制和環(huán)境友好型藥劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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