葉廣彬，銀聯(lián)飛，王長(zhǎng)麗，孫珊珊，楊睿睿，葛菁萍

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 百色 533000；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080）

2,3-丁二醇（2,3-butanediol，2,3-BD）及其衍生物作為一種應(yīng)用極其廣泛的化工原料，社會(huì)需求量大[1-3]。一直以來(lái)，傳統(tǒng)誘變技術(shù)存在著正向突變頻率低，難以控制其變異的方向和性質(zhì)，以及回復(fù)突變等問(wèn)題[4-5]。與傳統(tǒng)的育種方法相比，使用代謝工程手段改造菌株引起了眾多2,3-丁二醇研究者的關(guān)注。典型的2,3-丁二醇代謝途徑是一個(gè)產(chǎn)物以2,3-丁二醇為主，乳酸、乙酸、和琥珀酸等混合酸為副產(chǎn)物的生成過(guò)程，因此，混合酸發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因敲除與目標(biāo)產(chǎn)物合成支路的關(guān)鍵酶基因強(qiáng)化表達(dá)就順理成章的成為定向改造菌種的常規(guī)手段[6-15]。

乳酸是克雷伯氏菌（Klebsiella）以葡萄糖為底物發(fā)酵代謝生產(chǎn)2,3-丁二醇的主要副產(chǎn)物之一，其代謝支路是由乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）催化丙酮酸而產(chǎn)生，乳酸的大量合成會(huì)改變發(fā)酵液環(huán)境中pH，并對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用而影響菌體生長(zhǎng)，進(jìn)而影響2,3-丁二醇的產(chǎn)量[16-17]。因此，減少乃至消除乳酸的產(chǎn)生將是一種通過(guò)微生物代謝調(diào)控提高2,3-丁二醇產(chǎn)量的理想策略[18-22]。JI X J等[23]采用Red同源重組技術(shù)敲除產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ME-UD-3中的乙醇脫氫酶基因，獲得了乙醇脫氫酶缺失重組菌株。結(jié)果表明，乙醇脫氫酶基因敲除后，在以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的產(chǎn)量為90.75 g/L，同比原始菌株的87.67 g/L提高了3.5%。同時(shí)副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量由2.73 g/L下降到0.98 g/L，降低了64%。JUNG M Y等[24]采用Red同源重組技術(shù)成功敲除產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）KCTC2190的乳酸脫氫酶基因，通過(guò)蔗糖蜜為底物發(fā)酵結(jié)果顯示，在發(fā)酵40 h后發(fā)酵液中未檢出乳酸含量，而2,3-丁二醇的產(chǎn)量為13.25 g/L，對(duì)比原始菌株2,3-丁二醇產(chǎn)量10.02 g/L提高了32.3%。

由此可見(jiàn)，利用基因工程手段靶向性地實(shí)現(xiàn)2,3-丁二醇高產(chǎn)是一種切實(shí)可行的方法。為研究乳酸含量對(duì)2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響，本研究利用Red同源重組技術(shù)敲除乳酸脫氫酶（ldh）基因，企圖摸索一套完善的產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）HD79乳酸脫氫酶基因缺失菌株的構(gòu)建方法，從而為提高2,3-丁二醇的產(chǎn)量及增加工業(yè)菌種選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌種產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）HD79、E.coliDH5α、質(zhì)粒pGP704-Cm和pKD46：黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；pMDTM18-T：大連寶生物有限公司。

1.1.2 試劑

XhoI、BamHI、BglII、Pfu脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、氯霉素和L-阿拉伯糖：大連寶生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）prep Pure細(xì)菌總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、RealMasterMix（SYBR Green）：北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 引物

相關(guān)的擴(kuò)增引物由大連寶生物有限公司合成，如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Sequences of primer used in the study

1.1.4 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH調(diào)至7.0，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO46.6 g/L，K2HPO4·3H2O 8.7 g/L，KH2PO46.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，酵母提取物5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 g/L，MnSO4·H2O 0.001 g/L，CaCl2·2H2O 0.001 g/L。pH值至7.0，121 ℃滅菌15 min并與108 ℃滅菌20 min的150 g/L葡萄糖粉末在無(wú)菌條件下混合。

1.2 儀器與設(shè)備

JT-150雙人超凈工作臺(tái)：沈陽(yáng)醫(yī)用凈化設(shè)備廠；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；ZHWY-211C全溫度恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；Beckman Coulter Allegar?X-15R離心機(jī)：德國(guó)Beckman公司；HH-II-420-S恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HPX-87H色譜柱（300mm×7.8mm）、GenePulserXcell電穿孔儀：美國(guó)BIO-RAD公司；SCL-10A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；ABI7500熒光定量PCR儀：美國(guó)Life Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 基因元件的克隆

以K.oxytocaHD79基因組和質(zhì)粒pGP704-Cm為模板，ldh-L1/ldh-L2、ldh-R1/ldh-R2和Cm-F/Cm-R為引物分別對(duì)乳酸脫氫酶和氯霉素抗性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 2 μL，上下游引物（1 pmol/μL）各1 μL，PrimeSTAR Max Premix（2X）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.3.2 線性片段ldhL-Cmr-ldhR的構(gòu)建

圖1 同源重組片段ldhL-Cmr-ldhR完整構(gòu)建策略Fig.1 Whole construction strategy of homologous recombination fragment ldhL-Cmr-ldhR

線性片段ldhL-Cmr-ldhR的構(gòu)建思路如圖1所示，先行構(gòu)建質(zhì)粒pldh-LR和pT-LCR，其中pldh-LR是將ldh基因的左右同源臂拼接的重組質(zhì)粒；而pT-LCR是以pldh-LR為骨架，在ldh基因的同源臂中間插入替換基因Cmr；然后通過(guò)酶切獲得線性片段ldhL-Cmr-ldhR，用于后續(xù)的電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.3.3 電轉(zhuǎn)化

（1）同源輔助質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化K.oxytocaHD79

pKD46轉(zhuǎn)化K.oxytocaHD79的具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[25]。

（2）線性片段ldhL-Cmr-ldhR轉(zhuǎn)化K.oxytocaHD79/pKD46

將ldhL-Cmr-ldhR轉(zhuǎn)化到經(jīng)5 mmol/LL-阿拉伯糖誘導(dǎo)的含有質(zhì)粒pKD46的K.oxytocaHD79宿主菌中，使其與宿主菌中的ldh基因發(fā)生同源重組，以達(dá)到敲除ldh基因的目的。ldhL-Cmr-ldhR轉(zhuǎn)化K.oxytocaHD79/pKD46方法同上。

1.3.4 同源重組陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)

在終質(zhì)量濃度為150 μg/mL的氯霉素平板上挑取4個(gè)白色菌落，接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液為模板進(jìn)行l(wèi)dhL-Cmr-ldhR的兩端引物ldh-L1和ldh-R2驗(yàn)證，并將正確的PCR產(chǎn)物送交哈爾濱博仕生物科技公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.5 熒光定量PCR測(cè)定重組菌株ldh基因表達(dá)

設(shè)置供試菌株對(duì)照組和ldh敲除實(shí)驗(yàn)組，各組分別取2μL互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）作模板，以16S rRNA和ldh-R特異性引物進(jìn)行熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（fluorogenic quantitative-polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR），獲得各樣品的臨界循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）值，采用2-ΔΔCT相對(duì)定量法分析，以內(nèi)參基因16S rRNA校正[26]。ΔCT=待測(cè)樣品的目的基因CT均值—對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因的CT均值；ΔΔCT的計(jì)算公式如下：

ΔΔCT=各組ΔCT—對(duì)照組ΔCT

經(jīng)2-ΔΔCT計(jì)算后，將對(duì)照組中目的基因表達(dá)量設(shè)為1，其余各組相對(duì)于對(duì)照組的基因表達(dá)量的2-ΔΔCT。得出待測(cè)樣品的CT值，以CT值以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.3.6 重組菌株發(fā)酵產(chǎn)醇能力測(cè)定

重組菌株和供試菌株分別接種到種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以5%接種量分別接種到裝液量為150 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，底物葡萄糖150 g/L，30 ℃、150 r/min發(fā)酵156 h后結(jié)束。間隔12 h取樣，樣品經(jīng)處理后，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)乳酸、2,3-丁二醇及其他副產(chǎn)物的產(chǎn)量。

HPLC檢測(cè)條件：HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），RID-10A示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量20 μL，以0.005 mol/L稀硫酸為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，示差檢測(cè)器溫度40 ℃，色譜柱柱溫65 ℃，分析時(shí)間18 min。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著水平設(shè)定為0.05，極顯著水平設(shè)定為0.01。利用Duncan's新負(fù)極差進(jìn)行分析及多重比較，不同字母表示處理間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因元件的克隆

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2a-c所示：PCR產(chǎn)物ldh-L、ldh-R和Cmr與目的片段設(shè)計(jì)大小相符，分別為489 bp、400 bp和876 bp。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增所得的核苷酸序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)平臺(tái)上公布的基因序列比對(duì)一致，確保擴(kuò)增序列無(wú)突變。

圖2 ldh-L片段（a）、ldh-R片段（b）、Cmr片段（c）及l(fā)dhL-Cmr-ldhR（d）PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of ldh-L (a), ldh-R (b), Cmr (c) and ldhL-Cmr-ldhR (d) fragment

2.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

輔助質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)化至K.oxytocaHD79篩選結(jié)果如圖3a如示，質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化效率良好。線性片段ldhL-CmrldhR電轉(zhuǎn)化至K.oxytocaHD79/pKD46篩選結(jié)果如3b所示，在終質(zhì)量濃度150 μg/mL的氯霉素平板上隨機(jī)挑選4個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，再次接種在新的終質(zhì)量濃度150 μg/mL的氯霉素平板上，結(jié)果仍為陽(yáng)性。

圖3 電轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of electrotransformation

2.3 ldh基因缺失突變株鑒定

PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2d所示，泳道1～4均在約2 000 bp處有一清晰條帶，與ldhL-Cmr-ldhR即ldh-LR、Cmr片段大小之和相符，為1 765 bp。結(jié)合測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析表明重組片段ldhL-Cmr-ldhR整合到宿主菌K.oxytocaHD79的基因組上；初步說(shuō)明ldh基因缺失突變株構(gòu)建成功。

2.4 熒光定量PCR測(cè)定重組菌株ldh基因表達(dá)

ldh基因在重組菌株中相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果如圖4所示，重組菌株中的ldh基因相對(duì)表達(dá)量在24 h、48 h和72 h均明顯低于供試菌株，同比分別降低了76%、74%和66%，差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明了敲除基因ldh能有效地降低基因ldh的表達(dá)。

圖4 FQ-PCR測(cè)定不同時(shí)間處理組中l(wèi)dh基因的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative expression of ldh gene in different time treatment groups by FQ-PCR

2.5 重組菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)醇能力測(cè)定

搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定結(jié)果如表2所示，重組菌株相對(duì)供試菌株來(lái)說(shuō)，其乳酸產(chǎn)量明顯降低，而2,3-丁二醇的產(chǎn)量增加，說(shuō)明試驗(yàn)基本達(dá)到預(yù)期敲除ldh基因的目的。重組菌株2,3-丁二醇最高產(chǎn)量比供試菌株提高了26.8%，2,3-丁二醇最高產(chǎn)量的積累時(shí)間也提前了12 h，而乳酸的最高產(chǎn)量同比則降低了49.3%。有趣的是，1,3-丙二醇的最高產(chǎn)量由5.33 g/L增加到8.04 g/L，提高了50.9%。此外，其他副產(chǎn)物乙酸、琥珀酸及乙醇的產(chǎn)量變化不大，差異不顯著。

表2 供試菌株和重組菌株的搖瓶發(fā)酵代謝產(chǎn)物峰值Table 2 Peak value of metabolites of tested strain and recombinant strain by flask fermentation

3 討論

同源輔助質(zhì)粒pKD46在線性片段ldhL-Cmr-ldhR轉(zhuǎn)化至宿主菌中起至關(guān)重要的作用。pKD46表達(dá)λRed系統(tǒng)發(fā)生同源重組所需要的Exo、Bet與Gam三種蛋白因子，而Gam蛋白作為一種保護(hù)外源DNA的多肽分子，可與宿主菌中自身重組系統(tǒng)的RecBCD核酸外切酶結(jié)合，抑制其對(duì)外源DNA的降解。此外，pKD46是一種溫敏型質(zhì)粒，當(dāng)溫度超過(guò)37 ℃時(shí)，容易自動(dòng)丟失，因此，為了獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)溫度控制在30 ℃。

菌體代謝途徑關(guān)鍵酶基因敲除往往會(huì)在一定程度上對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，這在許多關(guān)于克雷伯氏菌基因敲除研究報(bào)道中得到證實(shí)[27]。本研究中對(duì)產(chǎn)酸克雷伯氏菌乳酸脫氫酶基因的敲除出現(xiàn)了相類似的情況，即獲得的乳酸脫氫酶缺失重組菌株相對(duì)供試菌株生長(zhǎng)緩慢且2,3-丁二醇產(chǎn)量較低。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2,3-丁二醇，其產(chǎn)量受到很多因素的影響和限制，其中影響較大的有pH值、菌種、發(fā)酵方式和發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比等，尤其是培養(yǎng)基成分中的磷酸鹽配比對(duì)酸性產(chǎn)物缺失的重組菌株生長(zhǎng)及2,3-丁二醇產(chǎn)量有重要的影響[28-29]。必須通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的成分配比，以提高目的產(chǎn)物的底物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度。基于課題組前期的研究工作基礎(chǔ)，通過(guò)改變磷酸鹽的比例，確立了最佳培養(yǎng)基成份配比（詳見(jiàn)1.1.4發(fā)酵培養(yǎng)基），極大地改善重組菌株的生長(zhǎng)及2,3-丁二醇的產(chǎn)量。

乳酸作為產(chǎn)酸克雷伯氏菌生產(chǎn)2,3-丁二醇過(guò)程中的主要副產(chǎn)物之一，并與2,3-丁二醇代謝支路競(jìng)爭(zhēng)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide_reduced，NADH），在一定程度上降低了2,3-丁二醇的產(chǎn)量。本研究利用Red同源重組技術(shù)將K.oxytocaHD79的乳酸脫氫酶基因敲除，從根本上減少乳酸的積累，以期能提高2,3-丁二醇的產(chǎn)量。但最終所構(gòu)建成功的ldh缺失重組菌株在以150 g/L葡萄糖為底物搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乳酸的產(chǎn)量只比供試菌株降低了49.3%，并沒(méi)有表現(xiàn)出產(chǎn)乳酸功能完全喪失的預(yù)期現(xiàn)象，其原因可能是產(chǎn)酸克雷伯氏菌中存在乳酸脫氫酶同工酶。結(jié)合國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，缺失重組菌株基于維持其正常的生理代謝功能，所以基因敲除的效果往往不一定表現(xiàn)出相關(guān)產(chǎn)物合成能力完全丟失的性狀，可能是相關(guān)產(chǎn)物產(chǎn)量處于一個(gè)較低的合成水平[30-31]。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建K.oxytocaHD79乳酸脫氫酶基因缺失重組菌株，以考察阻斷乳酸代謝途徑對(duì)2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響。對(duì)K.oxytocaHD79乳酸脫氫酶基因缺失菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其比供試菌株的2,3-丁二醇產(chǎn)量提高26.8%，而乳酸產(chǎn)量則降低了49.3%，說(shuō)明ldh基因的缺失對(duì)K.oxytocaHD79的2,3-丁二醇產(chǎn)量有影響，對(duì)構(gòu)建高產(chǎn)2,3-丁二醇基因工程菌株扮演著重要角色。