馬佳佳，姜宇文，單春會，趙慧君，鐘小丹，郭 壯

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；3.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北 孝感 432003）

新疆維吾爾自治區(qū)的紅棗種植面積約46.67萬km2，年產(chǎn)量在300萬t左右，種植面積和產(chǎn)量均約占全國的1/3[1]。目前新疆地區(qū)紅棗加工以干果和棗片等粗加工為主，以紅棗果汁（漿）飲料、醋和酵素加工為輔，存在深加工程度不高、加工鏈條短和附加值低等問題[2]。作為高附加值產(chǎn)品，紅棗酒是利用酵母菌將原料中的糖分轉(zhuǎn)化為酒精制成的一類發(fā)酵型果酒，具有口感清爽和香氣怡人的特點[3]。工業(yè)化生產(chǎn)的紅棗酒需接入活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，較之自然發(fā)酵的果酒其品質(zhì)更為穩(wěn)定且安全性更高[4]。然而，紅棗酒加工中使用的活性干酵母多為國外進(jìn)口，且多為葡萄酒釀造專用，具有自主知識產(chǎn)權(quán)且專門針對紅棗酒發(fā)酵的酵母菌菌株尚少。釀酒文化在我國具有幾千年的歷史，白酒[5]、黃酒[6]和米酒[7]不僅產(chǎn)品種類繁多，其酒曲[8]、酒醅[9]或窖泥[10]中亦蘊含了寶貴的酵母菌微生物資源，因而從中分離、鑒定和篩選適合于紅棗酒加工用的酵母菌株具有較強的可行性和微生物資源開發(fā)保護(hù)價值。

作為中國地理標(biāo)識產(chǎn)品，孝感鳳窩酒曲真菌以淀粉霉（Amylomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和曲霉屬（Aspergillus）為主，其中酵母菌的含量占到了真菌總量的1/3[11]，具有較高的多樣性，為紅棗酒加工用酵母菌菌株的篩選提供了良好的素材?？勰覐?fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）又稱扣囊復(fù)膜孢酵母或扣囊擬內(nèi)孢霉，在我國各類酒曲中大量存在[12]，具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和酸性蛋白酶等特性[13]，在紅棗酒中應(yīng)用可顯著提升酒體中乙酸乙酯的含量[14]。紅棗富含豐富的氨基酸，其不僅參與人體正常的新陳代謝，具有生物活性與功能，同時對果酒的滋味品質(zhì)具有重要的影響[15]。

本研究從湖北省孝感市采集了15個鳳窩酒曲樣品，采用純培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的手段對其中蘊含的酵母菌菌株進(jìn)行了分離鑒定，同時選取扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行了紅棗酒制備，并對其氨基酸種類和含量進(jìn)行了分析，以期為后續(xù)紅棗加工用酵母菌的篩選提供菌株支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酒曲：市售。

M13F（-47）/M13R（-48）和NL1/NL4：均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司合成；脫氧核糖核苷三磷酸、rTaq酶、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液和pMD18-T載體：大連寶生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）合成培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氨基酸分析儀配套緩沖溶液1、緩沖液2、緩沖液5和緩沖液6：英國Biochrom公司。其中引物為NL1/NL4（NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'；NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）和M13F（-47）/M13R（-48）（M13F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）。

駿棗：新疆維吾爾自治區(qū)石河子市；白砂糖（食品級）：柳州市柳冰食品廠；果膠酶（5萬U/g）：和氏璧生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級）：意大利ESSECO集團；酒石酸：南祥瑞食品添加有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSSE Ci-L顯微鏡：日本NiKon公司；PTC-100PCR儀：美國ABI公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；WZS手持式折射儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀：英國Biochrom公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集

于湖北省孝感市云夢縣的城北菜市場、珍珠坡菜市場以及大悟縣的三里菜市場選取無霉變、無蟲眼及無異味的米酒曲樣品，共采集15 份，其編號依次為HB1～HB15。

1.3.2 酵母菌的分離與鑒定

用生理鹽水對研碎后的米酒曲分別進(jìn)行倍比稀釋，取10-1～10-5稀釋液100 μL涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～30 h，根據(jù)菌落形態(tài)與大小進(jìn)行單菌落挑選，純化3次后鏡檢，凍存?zhèn)溆?。按照下述方法對酵母菌基因組進(jìn)行提取和26S rDNA PCR擴增[16]。擴增體系：10×PCR 緩沖溶液2.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸2.0 μL、DNA聚合酶0.5 μL、引物NL1和NL4各0.5 μL、無菌水18.5 μL和DNA模板0.5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用清潔試劑盒進(jìn)行純化，連接和轉(zhuǎn)化并挑陽性克隆子送武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司測序。序列切除引物后，在美國國立生物技術(shù)信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對，進(jìn)而明確酵母菌的分類地位[17]。

1.3.3 紅棗酒的制作

取100 g去核駿棗加入500 mL蒸餾水和0.036 g偏重亞硫酸鉀后破壁打漿，棗漿靜置30 min，加入0.18 g果膠酶，45 ℃酶解2 h后，使用白砂糖將其可溶性固形物調(diào)至24°Bx并用酒石酸調(diào)pH值至3.80，68 ℃水浴殺菌1 h，備用[18]。將

1.3.2 中鑒定為釀酒酵母和扣囊復(fù)膜酵母的菌株，在YPD培養(yǎng)基中活化三代后離心收集菌體，按照5×107CFU/mL紅棗漿的比例接入菌體，發(fā)酵罐罐口4 層紗布封口后，20 ℃發(fā)酵，若發(fā)酵液的糖度在48h內(nèi)保持不變，則判定為發(fā)酵結(jié)束。紅棗酒用紗布袋過濾后4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.3.4 紅棗酒中氨基酸含量的測定

參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中約束方法對紅棗酒樣品進(jìn)行預(yù)處理。測試條件：色譜柱為磺酸型陽離子樹脂，檢測波長為440 nm和570 nm，溫度梯度為38 ℃、50 ℃和93 ℃，緩沖液1、2、5和6分別洗脫9 min、12 min、20 min和6 min，流速為35 mL/h。

1.3.5 統(tǒng)計分析

使用PAST3.0軟件計算香農(nóng)指數(shù)和超1指數(shù)；使用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其他圖使用Origin 2017繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 孝感地區(qū)米酒曲中酵母菌的分離與鑒定

圖1 部分疑似酵母菌菌落特征及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and cell morphology of some suspected yeast strains

由圖1可知，菌株HBUAS61076的菌落偏小、呈乳白色圓形、表面濕潤光滑且中間凸起，菌體為卵形；菌株HBUAS61089的菌落亦偏小、呈乳黃色圓形、表面濕潤光滑且中間凸起，菌體為橢圓形；菌株HBUAS61093的菌落偏大、呈白色圓形、表面粗糙干燥且中間凸起，菌體為橢圓形并能形成假菌絲。

本研究采用分子生物學(xué)方法對疑似酵母菌分離株26S rDNA基因序列進(jìn)行了擴增及測序，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于26S rDNA基因的部分酵母菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of partial yeast strains based on 26S rDNA gene

由圖2可知，HBUAS61116等15 株菌株與模式菌株Saccharomycopsis fibuligeraATCC 36309聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）；HBUAS61081等8 株菌株與模式菌株P(guān)ichia anomalaNRRL Y-366聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為皮希亞諾姆拉酵母（Pichia anomala）；HBUAS61079等8 株菌株與模式菌株Candida glabrataATCC 2001聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為光滑假絲酵母（Candida glabrata）；HBUAS61080等7株菌株與模式菌株Cyberlindnera fabianiiNRRL 1871聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii）；HBUAS61108等3株菌株與模式菌株Saccharomyces cerevisiaeNRRL Y-12632聚在一支且相似度等于100%，被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；HBUAS61110等2 株菌株與模式菌株Candida tropicalisATCC 750聚在一支且相似度≥99%，被鑒定為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）；HBUAS61107菌株與模式菌株P(guān)ichia kudriavzeviiCBS5147聚在一支且相似度等于100%，被鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；HBUAS61120菌株與模式菌株Clavispora lusitaniaeNRRL Y-11827聚在一支且相似度等于100%，被鑒定為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）。各米酒曲樣品酵母菌分離鑒定情況如表1所示。

由表1可知，45 株酵母菌共被鑒定為8 個種，其中15 株為S.fibuligera，占分離株總數(shù)的33.33%。樣品HB2和HB5分別分離出3株和4株酵母菌，被鑒定為3個和4個物種，香農(nóng)指數(shù)分別為1.1和1.39，超1指數(shù)分別為6和10，而樣品HB1、HB6、HB8和HB15分別分離出2 株或3 株酵母菌，但均被鑒定為1個種，其香農(nóng)和超1指數(shù)均為0和1。由此可見，S.fibuligera為孝感地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢酵母菌，且不同米酒曲間酵母菌豐度和多樣性存在較大的差異。

表1 鳳窩酒曲樣品酵母菌分離鑒定統(tǒng)計Table 1 Isolation and identification statistics of yeast strains from Fengwo Jiuqu

2.2 紅棗酒氨基酸種類及含量分析

由表2可知，紅棗酒中共檢測到12種氨基酸，氨基酸總量為3.019 mg/mL，其中必需氨基酸有5種，累計含量為0.282 mg/mL，非必需氨基酸有7種，累計含量為2.737mg/mL。紅棗酒中含量最多的氨基酸為脯氨酸，含量為1.662 mg/mL，其次為天冬氨酸，含量為0.737 mg/mL。由此可見，紅棗酒中的氨基酸以脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸為主。黃酒中富含豐富的氨基酸，因而本研究結(jié)合參考文獻(xiàn)[17]將紅棗酒與丹陽封缸酒的氨基酸構(gòu)成進(jìn)行了比較分析。

由表2亦可知，丹陽封缸酒中氨基酸的總量為2.497mg/mL，共檢測出7 種必需氨基酸和10種非必需氨基，甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和纈氨酸僅在丹陽封缸酒中檢測到。此外，紅棗酒中必需氨基酸所占的比例為9.3%，而丹陽封缸酒中這一比例高達(dá)42.4%。由此亦可知，較之丹陽封缸酒，雖然氨基酸的種類和必需氨基酸構(gòu)成均明顯偏少，但紅棗酒氨基酸總量明顯偏高。

表2 紅棗酒中氨基酸組成分析Table 2 Analysis of amino acid composition of jujube wine

本研究進(jìn)一步對紅棗酒中鮮、酸、澀、苦和甘5種呈味氨基酸的構(gòu)成進(jìn)行了分析與比較，結(jié)果見表2。由表2可知，紅棗酒中鮮味呈味氨基酸平均含量為0.132 mg/mL，占氨基酸總量的4.4%，變異系數(shù)為18.6%；酸味呈味氨基酸平均含量為0.737 mg/mL，占氨基酸總量的24.4%，變異系數(shù)為25.1%；澀味呈味氨基酸平均含量為0.057 mg/mL，占氨基酸總量的1.9%，變異系數(shù)為11.8%；苦味呈味氨基酸平均含量為0.067 mg/mL，占氨基酸總量的2.2%，變異系數(shù)為16.3%；甘味呈味氨基酸平均含量為2.026 mg/mL，占氨基酸總量的67.1%，變異系數(shù)為15.5%。由所測數(shù)據(jù)可得，紅棗酒中甘味呈味氨基酸含量最多，其次為酸味呈味氨基酸，而鮮、苦和澀味呈味氨基酸的含量均相對較少。相較之丹陽封缸酒，其甘味呈味氨基酸占總氨基酸的56.4%，為其主要呈味氨基酸，澀味和苦味呈味氨基酸的含量亦較高，分別占19.6%和14.9%，而酸味和鮮味呈味氨基酸含量較少，分別占5.4%和3.7%。由此可見，紅棗酒以甘味和酸味氨基酸為主，與丹陽封缸酒存在明顯的差異。

3 結(jié)論

S.fibuligera為孝感地區(qū)米酒曲中的優(yōu)勢酵母菌，且不同米酒曲間酵母菌豐度和多樣性存在較大的差異。以S.fibuligera和S.cerevisiae分離株進(jìn)行紅棗酒制備，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅棗酒中的氨基酸以脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸為主，呈味氨基酸以甘味和酸味為主。