付瑾瑾，白昱慧，朱曉玲，沈洋洋，范念斯，金仁村

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院水污染治理實驗室，浙江 杭州 311121)

隨著城市化進(jìn)程的不斷加快，抗生素被過度使用，而未完全降解的抗生素廣泛分布于養(yǎng)殖場、污水處理廠(包括進(jìn)、出水口及污泥)、醫(yī)用廢水和藥物生產(chǎn)廢水中[1].環(huán)境中殘留的抗生素會引發(fā)抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的產(chǎn)生，ARGs在環(huán)境中傳播和擴散已經(jīng)對公共健康和食品、飲用水安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅.目前，ARGs在各種環(huán)境介質(zhì)中均有檢出.Kim等[2]發(fā)現(xiàn)，ARGs存在于天然土壤和農(nóng)業(yè)土壤中，以四環(huán)素類抗性基因居多；Dang等[3]在典型海水養(yǎng)殖環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了多耐藥菌株，并在其中檢測到tetA、tetB和tetM，表明海水養(yǎng)殖環(huán)境中存在ARGs污染的風(fēng)險；Yi等[4]在垃圾填埋場滲濾液中檢測出sul1、sul2、dfrA、aac6、tetO和qnrA，其中sul1豐度為1.995×105gene copies·mL-1.Liang等[5]在鄱陽湖表層水中檢測到12種ARGs，包括7種四環(huán)素類抗性基因、3種磺胺類抗性基因和2種喹諾酮類抗性基因.Li等[6]檢測到北京自然濕地野鴨湖和人工濕地白河底泥中ARGs豐度分別為1.60×107和4.67×108copies·g-1.Jiang等[7]在黃浦江中檢測到9種ARGs，其平均豐度在3.66×101(tetB)和1.62×105copies·mL-1(sul2)之間.細(xì)菌耐藥性不斷增加，而有效的治療方案卻嚴(yán)重滯后[8]，抗生素和抗性基因的廣泛存在與傳播將嚴(yán)重影響環(huán)境狀況和人類健康，是人類亟待解決的問題.

西溪國家濕地公園是已有1 000多年歷史的典型城市濕地公園，不僅生態(tài)資源豐富，更擁有深厚的文化底蘊和優(yōu)美的自然景觀，池塘、河港、沼澤、湖漾，有“一曲溪流一曲煙”之美譽.但西湖引水造成的二次污染、濕地南部房地產(chǎn)開發(fā)和道路面積增加導(dǎo)致的徑流污染，以及余杭塘河污水在洪水期返流到濕地公園內(nèi)等問題嚴(yán)重影響了西溪濕地的生態(tài)環(huán)境[9].此外，西溪濕地曾發(fā)展過畜禽業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等，抗生素的使用導(dǎo)致動物體內(nèi)產(chǎn)生ARGs，并隨著糞便排入養(yǎng)殖區(qū)域及其周邊環(huán)境，加之旅游業(yè)的發(fā)展帶來的人流量不斷增大，人類活動也可能對ARGs種類和濃度產(chǎn)生影響.目前，關(guān)于西溪濕地ARGs的研究還未見報道，為此，本文以西溪濕地為研究對象，對其ARGs分布、豐度進(jìn)行初步評估，為進(jìn)一步開展西溪濕地水體環(huán)境中的抗生素尤其是ARGs的污染研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

圖1 西溪濕地ARGs采樣點分布圖Fig.1 Sampling sites of ARGs in Xixi Wetland

西溪國家濕地公園位于浙江省杭州市西部，東臨蔣村街道，西接五常街道，南至天目山路，北至文二西路，總占地面積11.52.鑒于西溪濕地曾用于養(yǎng)殖牲畜、家禽等，并經(jīng)營過魚塘，且部分區(qū)塊對外開放，本實驗將其分為自然區(qū)域(N)和人為活動區(qū)域(H)，選擇20個具有代表性的自然區(qū)域和人為活動區(qū)域(各10個)設(shè)置采樣點(圖1).采樣時將底泥中的砂礫和枯枝爛葉等雜質(zhì)去除，每個采樣點取密度相當(dāng)?shù)牡啄? kg左右，并將其分裝在事先準(zhǔn)備的樣品袋中，存放于裝有冰袋的泡沫盒，迅速帶回實驗室，置于-20 ℃的冰箱中冷藏備用.

1.2 儀器及試劑

主要儀器：超凈工作臺(SW-CJ-2FD型雙人凈化工作臺)、FPG系列多段可編程光照培養(yǎng)箱(寧波萊?？萍加邢薰?、722型分光光度計(上海江儀儀器有限公司)、WH861型渦旋振蕩器(江蘇太倉華利達(dá)實驗室設(shè)備公司)、GI54DS型高壓蒸汽滅菌鍋(廈門至微儀器有限公司)、微量移液器(Eppendorf，德國)、DM6000B光學(xué)顯微鏡(Leika，德國)、5417R型高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)、冰箱(Haier集團(tuán))、電子天平(Mettler Toledo PL203)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)、pH計(Mettler Toledo DELTA 320)、磁力攪拌器(JB-3)、HH-4型恒溫水浴鍋(金壇市富華電器有限公司)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-2型).

主要試劑：細(xì)菌蛋白胨(蛋白胨、瓊脂、瓊脂糖和NaCl等常規(guī)樣品及試劑，均為國產(chǎn)分析純)、引物、Taq DAN Polymerase、DNA Marker、dNTPs、Mobio試劑盒.

1.3 樣品中細(xì)菌總DNA的提取

將底泥樣品的水分用紙吸干，稱取0.5 g底泥樣品，采用Power Soil DNA Kit試劑盒(Mo Bio Laboratories, USA)進(jìn)行DNA的提取，步驟參考試劑盒說明書.提取的總細(xì)菌基因組DNA樣品存于-20 ℃的冰箱中備用.

1.4 PCR擴增

取出DNA樣品于冰上凍融，對樣品中16種四環(huán)素類抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetZ、tetX、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT和tetW)和3種磺胺類抗性基因(sul1、sul2和sul3)進(jìn)行擴增.目的抗性基因引物詳細(xì)信息見表1.

擴增體系：25 μL，其中包括12.5 μL Green Master Mix、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2.0 μL模板DNA，其余體積用ddH2O補足.

擴增條件：在95 ℃條件下先進(jìn)行預(yù)變性處理，時長5 min；然后在95 ℃條件下進(jìn)行熱變性處理，時長30 s；接著退火30 s(各引物的退火溫度見表1)，最后在72 ℃條件下延伸30 s，整個過程一共進(jìn)行40個循環(huán).

表1 抗性基因引物序列及其退火溫度Tab.1 The primer sequence and annealing time of ARGs

擴增產(chǎn)物置于4 ℃冰箱低溫冷藏保存，用瓊脂凝膠電泳(膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，電壓為120 V)檢測產(chǎn)物，利用DNA膠回收試劑盒(Axygen, USA)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收.將純化的目的片段連接到pMDTM19-T(Takara, Japan)載體中，利用熱擊法將其轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara, Japan)中進(jìn)行搖菌培養(yǎng).經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選均勻圓潤的陽性克隆子，于1 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床4 h，委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序.測序完成后返回質(zhì)粒用于定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備.

1.5 實時熒光定量PCR

盡管按1.4方法對19種ARGs進(jìn)行了擴增，但僅擴增出6種ARGs，包括4種四環(huán)素類抗性基因(tetA、tetC、tetX、tetM)和2種磺胺類抗性基因(sul1、sul2).采用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR, qPCR)方法對底泥樣品中擴增出的抗性基因的豐度進(jìn)行定量，采用的定量PCR儀為iCycler iQ5(Bio-Rad, California, USA).qPCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Bio Inc., Shiga, Japan)，0.5 μL正向引物(20 mmol·L-1)，0.5 μL 反向引物(20 mmol·L-1)和1 μL DNA模板(1～10 ng)，剩余部分由ddH2O補足.

擴增程序：預(yù)變性3 min(96 ℃)，變性30 s(96 ℃)，退火30 s(退火溫度見表1)，延伸30 s(72 ℃)，共40個循環(huán).

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因的分布特征

通過PCR擴增技術(shù)對各底泥中16種四環(huán)素類和3種磺胺類ARGs進(jìn)行擴增，成功擴增出4種四環(huán)素類抗性基因(tetA、tetC、tetX、tetM)和2種磺胺類抗性基因(sul1、sul2).擴增出的6種ARGs在各采樣點的檢出情況如表2所示，所有采樣點均檢測出2種磺胺類抗性基因，4種四環(huán)素類抗性基因的檢出率分別為90%、95%、90%和30%.其中，自然區(qū)域僅有2個采樣點(N1和N3)檢測出6種抗性基因，而人為活動區(qū)域有4個點(H1、H2、H6和H8)檢測出所有抗性基因；且人為活動區(qū)域其他6個采樣點檢測到除tetM外的其他抗性基因，相較之下，自然區(qū)域未呈現(xiàn)此規(guī)律.

表2 西溪濕地抗性基因篩選Tab.2 Screening of resistance genes in Xixi Wetland

Huang等[15]在研究珠江三角洲典型淡水養(yǎng)殖模式(魚塘、鴨塘、鴨-魚組合塘)的水體和沉積物中ARGs的分布情況時發(fā)現(xiàn)，tetA可能是四環(huán)素類抗性基因在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的潛在指標(biāo).磺胺類抗生素廣泛應(yīng)用于人體和獸醫(yī)領(lǐng)域，在環(huán)境中極易存留且易產(chǎn)生耐藥性，因此，大量磺胺類抗性基因被轉(zhuǎn)移到環(huán)境中[16].Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，長江口和沿海地區(qū)海岸沉積物中磺胺類抗性基因的總水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于四環(huán)素類抗性基因，且tetA比tetM的分布更為普遍.相關(guān)研究還表明，在廢水處理過程中，磺胺類抗性基因比四環(huán)素類抗性基因更難降解[18].張子揚等[19]在研究人工濕地對畜禽養(yǎng)殖廢水中磺胺類抗性基因的去除時發(fā)現(xiàn)，畜禽養(yǎng)殖廢水是磺胺類抗性基因sul1、sul2及sul3的重要來源，且這3種基因可在人工濕地內(nèi)部土壤中積累.西溪濕地曾經(jīng)大力發(fā)展畜禽養(yǎng)殖業(yè)，這可能導(dǎo)致西溪濕地磺胺類抗性基因具有一定的環(huán)境本底值，因此兩種磺胺類抗性基因的檢出率均為100%.

Chen等[20]在研究人類活動對珠江流域ARGs的影響時發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗性基因(tetB、tetC、tetM、tetO和tetW)廣泛存在于珠江流域，且其總濃度和多樣性隨人為影響的增加而增加.在研究南普拉特河流域上游居民對河流抗生素的影響時，Pruden等[21]發(fā)現(xiàn)抗性基因檢出水平與人類活動呈顯著正相關(guān).Yan等[22]在研究三峽水庫四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素及其抗性基因時發(fā)現(xiàn)，ARGs的相對豐度與醫(yī)院和畜牧場附近殘留的抗生素濃度之間存在顯著的關(guān)系，這表明人類活動可能在加劇抗生素傳遞方面發(fā)揮著重要作用.Chen等[23]在研究西藏地區(qū)土壤和動物糞便中的ARGs時發(fā)現(xiàn)，在人類活動比較頻繁的區(qū)域，ARGs的種類和豐度均比人類活動較少的區(qū)域高很多.和以上研究結(jié)果相似，本研究中除tetM在人為活動區(qū)域僅分布在4個采樣點外，其余ARGs在人為活動區(qū)域的檢出率均為100%，而自然區(qū)域僅2種磺胺類抗性基因的檢出率為100%.

研究表明，西溪濕地受周圍環(huán)境干擾的程度與其距濕地邊緣地帶的距離呈負(fù)相關(guān)[24].H1位于西溪濕地邊緣地帶，H2和H3位于西溪濕地主干道，這可能是這3個采樣點ARGs拷貝數(shù)顯著高于其他采樣點的原因之一.謝平等[25]在研究南水北調(diào)工程對漢江中下游水華的影響時曾提出，水體流動性差異將導(dǎo)致水體自凈能力存在差異.由表2不難發(fā)現(xiàn)，僅有少數(shù)采樣點(N1、N3、H1、H2和H6)檢測到了所有ARGs，這些采樣點均位于橋下，而池塘的所有采樣點均未檢測到全部基因，這可能是因為橋下水體流動性比池塘好，導(dǎo)致ARGs的傳播來源和污染范圍更大，因此橋下ARGs種類比池塘豐富.

2.2 抗性基因定量結(jié)果及相關(guān)性分析

如圖2所示，四環(huán)素類抗性基因tetA和tetC的拷貝數(shù)在采樣點H1均為最高，分別為4.85×106和1.87×103copies·mg-1VSS.tetX拷貝數(shù)最高的是人為活動區(qū)域的采樣點H3，達(dá)1.13×105copies·mg-1VSS，其次為H7、H5、H2和H6，拷貝數(shù)分別為7.93×104、4.60×104、3.46×104和2.30×104copies·mg-1VSS.僅有自然區(qū)域的2個采樣點(N3、N1)和人為活動區(qū)域的4個采樣點(H8、H6、H1、H2)檢測到抗性基因tetM，其中人為活動區(qū)域的采樣點H8拷貝數(shù)最高，為1.73×104copies·mg-1VSS，其余采樣點的tetM拷貝數(shù)表現(xiàn)為H6>H1>H2>N3>N1，分別為1.10×104、1.04×104、9.41×103、5.68×103和4.75×103copies·mg-1VSS.磺胺類抗性基因sul1拷貝數(shù)較高的區(qū)域大多分布在人為活動區(qū)域內(nèi)，其中H2、H6、H1和H8的基因拷貝數(shù)分別為2.10×104、1.99×104、1.50×104和1.21×104copies·mg-1VSS.磺胺類抗性基因sul2拷貝數(shù)較高的區(qū)域依然主要分布在人為活動區(qū)域，其中H3和H2的基因拷貝數(shù)與其他采樣點差距較大，比其他采樣點高出至少一個數(shù)量級.顯然，檢測到的6種ARGs在人為活動區(qū)域的拷貝數(shù)整體上較自然區(qū)域高.

對檢測到的6種ARGs進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析(圖3)，其中tetA和tetC、tetC和tetX、tetC和tetM、tetC和sul1、tetC和sul2、tetX和sul2、tetM和sul1以及sul1和sul2均具有顯著相關(guān)性，且均為正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.73、0.48、0.51、0.72、0.58、0.92、0.74和0.47.祁詩月等[26]在河南新鄉(xiāng)19家養(yǎng)殖場的動物糞便中均檢測到多重抗性細(xì)菌，而本研究中多種抗性基因之間呈顯著正相關(guān)，表明單一抗生素壓力有可能促進(jìn)細(xì)菌多重抗性的產(chǎn)生[27].

注：藍(lán)色部分為自然區(qū)域的10個采樣點(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10)，紅色部分為人為活動區(qū)域的10個采樣點(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10).

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在0.01水平上顯著相關(guān).

Wei等[28]在研究河北、河南、四川和江蘇4省的糞肥蔬菜農(nóng)場土壤中17種獸醫(yī)抗生素殘留情況時發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素的檢出率為54.72%，平均殘留水平高達(dá)82.75 mg·kg-1，而磺胺類抗生素的檢出率達(dá)77.36%，平均殘留水平為2.61 mg·kg-1，這與本研究中兩類抗性基因檢出水平相符.羅方園等[29]檢測到洪澤湖沉積物中tetA、tetC和tetM的最高檢出限分別為1.01×106、3.75×107和3.03×105copies·g-1.而本研究所采集底泥中四環(huán)素類抗性基因的拷貝數(shù)高達(dá)1.05×105copies·mg-1VSS.Jia等[30]對西安灞河14種7類抗菌藥物相應(yīng)抗性基因的分布進(jìn)行了調(diào)查，其中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類的檢出率為85.7%～100%，四環(huán)素的檢出率和豐度均最高.美國USGS調(diào)查了近30個州的140個水域環(huán)境(河流、池塘等)，檢測到不同河流中有21種豐度不同的ARGs，并且這些ARGs在水環(huán)境中的拷貝數(shù)均小于1.0×103copies·mg-1VSS[31].而本研究中多個采樣點的多種ARGs拷貝數(shù)要比美國各州的高出1～3個數(shù)量級，說明西溪濕地底泥中ARGs污染水平較高.

相關(guān)研究表明，四環(huán)素類抗性基因?qū)饨到夂苊舾?，且可被基質(zhì)吸附[32]，加之四環(huán)素具有很多極性離子官能團(tuán)[33]，且底泥對其具有較強的吸附能力[34]，因此四環(huán)素類抗性基因易在底泥中積累，經(jīng)食物鏈傳播或其他方式進(jìn)入人體危害人類健康.ARGs誘導(dǎo)具有專一性,抗生素誘導(dǎo)的ARGs在環(huán)境中的傳播和抗生素本身在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及歸趨等環(huán)境行為具有相似性和一致性[35]，且ARGs具有“不易消亡或環(huán)境持久”的物理化學(xué)特性和“可復(fù)制或可傳播”的生物學(xué)特性，能夠在細(xì)菌間進(jìn)行傳播和擴散[36]，因此，開展環(huán)境中ARGs水平的調(diào)查是十分有必要的.

另外，Zhang等[37]在研究廣州最大的垃圾滲濾液處理廠中ARGs的豐度時發(fā)現(xiàn)，垃圾滲濾液中含有大量的ARGs，其豐度在夏季、冬季、春季呈由高到低的趨勢，與季節(jié)變化呈顯著相關(guān)性.Suzuki等[38]對日本海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的抗性基因sul2和tetM進(jìn)行了長達(dá)1年的監(jiān)測，結(jié)果表明日本海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中全年都存在sul2，而只在五月和七月檢測出了tetM.不同動物物種對ARGs的多樣性、豐度和持久性有顯著的影響，其中轉(zhuǎn)座子的豐度、重金屬濃度、總氮水平、抗生素的劑量和持續(xù)時間均會造成ARGs的差異[39].相關(guān)研究表明，四環(huán)素抗性基因豐度與pH值呈負(fù)相關(guān)[40]；N?lvak等[41]在研究水平潛流人工濕地ARGs動態(tài)及其與系統(tǒng)處理效率的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)運行參數(shù)，特別是時間和溫度對濕地生物膜和出水中ARGs的濃度均有影響.西溪濕地作為國家級濕地公園，其水環(huán)境中ARGs污染與治理等諸多問題亟待解決，今后迫切需要開展西溪濕地水環(huán)境中各類抗生素及其抗性基因污染水平的調(diào)查研究工作，從而對西溪濕地抗生素、ARGs的生態(tài)風(fēng)險進(jìn)行評估，以改善西溪濕地ARGs的污染狀況，并對其他同類型地區(qū)抗性基因治理提供方向.

3 結(jié)論

西溪濕地底泥中主要檢測出四環(huán)素類(tetA、tetC、tetX、tetM)和磺胺類(sul1、sul2)6種ARGs，且除tetM(30%)外，其他5種ARGs的檢出率均在90%以上.四環(huán)素類抗性基因平均拷貝數(shù)為1.05×105copies·mg-1VSS，高于很多其他水域的底泥，說明西溪濕地ARGs污染較嚴(yán)重，且6種ARGs中多種ARGs呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性.西溪濕地橋下檢測到的ARGs種類較池塘里多，可能與水體流動性相關(guān).此外，ARGs的產(chǎn)生和分布與人類活動密切相關(guān)，人類活動區(qū)域的ARGs檢出率和豐度均高于自然區(qū)域.同時，ARGs的產(chǎn)生和分布還受諸多其他方面因素的影響，例如季節(jié)變化、光照、溫度、pH等，其抗性機制仍有待研究.