周曼麗，俞赟豐，馮宇，簡維雄，2

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

冠心病血瘀證是一個(gè)“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀阻證期”流動(dòng)的過程，心肌細(xì)胞能量代謝貫穿始終，而以往對(duì)能量代謝的研究局限于病程中的某個(gè)階段，本研究通過構(gòu)建冠心病血瘀證形成過程的動(dòng)物模型模擬冠心病血瘀證形成的過程，進(jìn)而研究能量代謝酶的變化。結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞能量代謝酶參與冠心病血瘀證形成的整個(gè)過程；參與代謝相關(guān)的酶類中三磷酸腺苷（ATP）與一磷酸腺苷（AMP）水平變化最為關(guān)鍵，這將是腺苷活化蛋白激酶（AMPK）通路發(fā)揮應(yīng)激性心肌保護(hù)作用的重要信號(hào)，同時(shí)AMPK通路的激活很可能是觸發(fā)心肌細(xì)胞能量代謝其他酶類變化的上游效應(yīng)分子。這對(duì)血瘀證狀態(tài)下冠心病心肌細(xì)胞代謝機(jī)制的探索以及揭示心肌損傷修復(fù)和治療機(jī)制具有重要的意義。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。┲腹跔顒?dòng)脈發(fā)生粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。我國心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，盡管人們采取了各種現(xiàn)代化治療方法，如靜脈溶栓、心臟介入治療等，其發(fā)病率和死亡率仍居各類致死性疾病前列［1］。中醫(yī)古籍中并無冠心病之稱，其當(dāng)屬中醫(yī)胸痹真心痛的范疇。胸痹病機(jī)雖有血瘀、痰阻、寒凝、氣滯之別，但基本的病機(jī)是心脈不通，而血瘀證是冠心病中最常見的證型之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為證不是靜止不變而是動(dòng)態(tài)演變的，具有由輕及重的流動(dòng)性特點(diǎn)。冠心病血瘀證是一個(gè)“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀阻證期”流動(dòng)的過程［2］。能量代謝是疾病的一種反應(yīng)形式，病情在變化，能量自然也在變［3］。心臟利用能量的形式是三磷酸腺苷（ATP），而ATP來源于心臟對(duì)脂肪酸、糖類、乳酸、丙酮酸及酮體等多種供能物質(zhì)的代謝。能量代謝障礙是眾多急/慢性病變共同的病理生理基礎(chǔ)［4］，能量代謝過程中不同蛋白酶水平差異對(duì)于疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。本文旨在分析冠心病血瘀證心肌細(xì)胞能量代謝酶活性機(jī)制，以進(jìn)一步了解疾病發(fā)生背后的分子機(jī)制，進(jìn)而為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠共30只，體質(zhì)量（230±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠常規(guī)飼料和高脂飼料均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。大鼠在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度22～26 ℃，濕度50%～70%，3只/籠，定量給予常規(guī)飼料或高脂飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 維生素D3粉劑（購自湖北楚米生物科技有限公司，規(guī)格：10萬U/G，批號(hào)：2018012202）；異丙腎上腺素（購自美國Sigma公司，規(guī)格：1 g，CAS號(hào)：51-30-9）；ATP試劑盒（貨號(hào)：ml460314）、一磷酸腺苷（AMP）試劑盒（貨號(hào)：ml460319）、Na+-K+-ATP酶（貨號(hào)：ml058954）、Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒（貨號(hào)：ml059467）、酯酰輔酶A合成酶（acyl-coenzyme A synthetase，ACS）試劑盒（貨號(hào)：ml003386）、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine acyl transferase，CACT）試劑盒（貨號(hào)：ml003383）（規(guī)格均為48 T，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；2.5%戊二醛電鏡固定液（購自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：P1126）；組織固定液（購自武漢賽維爾生物科技公司，貨號(hào)：G1101）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MICRO17離心機(jī)（購自美國Thermo公司）；chemray240全自動(dòng)生化儀（購自深圳雷杜生命科技有限公司）；RT-6100酶標(biāo)分析儀（購自美國Rayto公司）；HT7700透射電子顯微鏡（購自日本HITACHI公司）；Leica UC7超薄切片機(jī)（購自德國Leica公司）；美國BIOPAC多導(dǎo)（16道）生理記錄儀（MP150）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年10—12月。

1.4.2 動(dòng)物分組及造模 30只大鼠采用常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用簡單隨機(jī)抽樣法分為空白對(duì)照組6只（A組）和模型大鼠24只。A組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，模型大鼠高脂飼料喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行維生素D3灌胃（30萬U/kg），4 d后再予以維生素D3灌胃（20萬U/kg），繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)21 d后，死亡4只大鼠，從剩余20只大鼠中隨機(jī)選擇6只為血瘀證前期組（B組），并采血取材；剩余14只大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)30 d后死亡2只，從剩余12只大鼠中隨機(jī)選擇6只為亞血瘀證期組（C組），并采血取材；余6只大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)予以皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素（5 mg/kg），連續(xù)注射3 d，1周后記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以ST段出現(xiàn)上抬或明顯壓低（≥0.1 mV）確定成模［5］，為血瘀證期組（D組），并采血取材。

1.4.3 標(biāo)本采集 為保證各指標(biāo)檢測(cè)的一致性，每組選取6只大鼠。大鼠麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，截取一段腹主動(dòng)脈放入組織固定液中以備行HE染色。開胸取心臟，取材時(shí)要快且避免牽拉傷。大鼠心臟分為3份，一份投入2.5%戊二醛固定液中4 ℃避光固定用于電鏡檢測(cè)；一份投入組織固定液中用于心肌HE染色；另一份投入-80 ℃冰箱中保存用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

1.4.4 觀察指標(biāo)

1.4.4.1 一般情況 觀察各組大鼠一般情況，包括大鼠反應(yīng)、活動(dòng)度、精神、皮毛、體質(zhì)量、爪甲等。

1.4.4.2 血脂指標(biāo) 使用chemray240全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組大鼠血脂指標(biāo)，包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.4.4.3 腹主動(dòng)脈及心肌組織HE染色結(jié)果 將腹主動(dòng)脈及心肌組織放入多聚甲醛液中固定；將組織塊放入包埋盒中修剪，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明浸蠟，將已透明的組織塊放入溶蠟箱保溫，待組織塊變硬開始切片；將切下的薄片放在45 ℃恒溫箱中烘干；二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水，倒入蒸餾水，進(jìn)行HE染色。觀察各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)及彈性纖維層情況。

1.4.4.4 心電圖 記錄各組大鼠心電圖檢查結(jié)果。

1.4.4.5 線粒體超微結(jié)構(gòu) 采用HT7700透射電子顯微鏡觀察各組大鼠線粒體形態(tài)、大小、嵴結(jié)構(gòu)等。

1.4.4.6 心肌組織能量代謝酶水平 采用ELISA檢測(cè)四組大鼠心肌組織能量代謝酶（ATP、AMP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、ACS、CACT）水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD（L）法，組間兩兩比較方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2（M）法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠一般情況 A組大鼠活動(dòng)自如，反應(yīng)靈敏，皮毛光亮；B組大鼠體質(zhì)量減輕，反應(yīng)漸遲鈍，精神倦怠，毛色枯槁無光澤；C組大鼠體質(zhì)量明顯減輕，精神萎靡，蜷縮相擁，活動(dòng)量少；D組大鼠精神欠佳，易驚，觸之狂躁，毛色枯槁無光澤，爪甲紫暗。

2.2 四組大鼠血脂指標(biāo)比較 四組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組大鼠TC、LDL-C、HDL-C水平高于A組，TG水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠TC、LDL-C、HDL-C水平高于A、B組，TG水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠HDL-C水平低于A、B、C組，TC、LDL-C水平低于B、C組，TG水平高于B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 四組大鼠腹主動(dòng)脈及心肌組織HE染色結(jié)果 大鼠腹主動(dòng)脈HE染色結(jié)果：A組大鼠動(dòng)脈內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)完整，層次分明，彈性纖維層結(jié)構(gòu)基本清晰；B組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)損傷，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)膜下及中膜出現(xiàn)明顯鈣化現(xiàn)象，彈性纖維層被破壞；C組大鼠動(dòng)脈中膜完全鈣化，中膜斑塊脫落導(dǎo)致典型的空腔結(jié)構(gòu)；D組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)彈性膜崩解斷裂，內(nèi)、中、外膜三層結(jié)構(gòu)不清晰（見圖1）。大鼠心肌組織HE染色結(jié)果：A組大鼠心肌纖維排列整齊規(guī)律，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則完整，細(xì)胞核清晰居中；B、C、D組大鼠心肌纖維萎縮斷裂，胞質(zhì)呈不規(guī)則粗顆粒狀，心肌間質(zhì)水腫，膠原纖維增生（見圖2，高清彩圖詳見本文OSID碼）。

2.4 四組大鼠心電圖 A組大鼠心電圖正常（見圖3a）；B組大鼠心電圖示P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無寬大畸形（見圖3b）；C組大鼠心電圖示竇性心律，P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，J點(diǎn)無明顯改變（見圖3c）；D組大鼠心電圖未見明顯P波，R-R間期大致相同，ST段明顯壓低，T波低平（＞0.1 mV）（見圖3d）。

表1 四組大鼠血脂指標(biāo)比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of blood lipid indexes in four groups

表1 四組大鼠血脂指標(biāo)比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of blood lipid indexes in four groups

注：A組為空白對(duì)照組，B組為血瘀證前期組，C組為亞血瘀證期組，D組為血瘀證期組；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇

組別 TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）A 組 1.61±0.22 1.86±0.89 0.25±0.09 1.25±0.23 B 組 3.95±0.92a 0.57±0.86a 2.82±0.87a 1.58±0.25a C組 6.78±1.58ab 0.58±0.22a 5.36±1.59ab 2.01±0.27ab D組 1.45±0.13bc 1.56±0.57bc 0.43±0.10bc 1.09±0.16abc F值 66.317 12.241 23.436 61.878 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 四組大鼠腹主動(dòng)脈HE染色結(jié)果（×20）Figure 1 Results of HE staining of abdominal aorta of rats in four groups

圖2 四組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 2 Results of HE staining in myocardial tissue of rats in four groups

2.5 四組大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu) A組大鼠線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰、完整；B組大鼠線粒體腫脹，部分線粒體嵴結(jié)構(gòu)出現(xiàn)溶解；C組大鼠線粒體嵴結(jié)構(gòu)大部分出現(xiàn)溶解、空泡形成，線粒體出現(xiàn)明顯移位、濃縮；D組大鼠線粒體排列紊亂、多數(shù)線粒體嵴結(jié)構(gòu)斷裂甚至模糊不清（見圖4）。

圖3 四組大鼠心電圖檢查結(jié)果Figure 3 Results of ECG examination of rats in four groups

2.6 四組大鼠心肌組織能量代謝酶水平比較 四組大鼠心肌 組 織 ATP、AMP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、ACS、CACT水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組大鼠心肌組織AMP、Ca2+-Mg2+-ATP酶、ACS、CACT水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠心肌組織ATP、AMP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平低于A組，ATP水平低于B組，ACS水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠心肌組織ATP、Na+-K+-ATP酶水平低于A、B組，AMP、ACS水平高于B組，ATP水平低于C組，AMP、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 四組大鼠心肌組織能量代謝酶水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of energy metabolizing enzyme levels in myocardial tissue of rats in four groups

表2 四組大鼠心肌組織能量代謝酶水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of energy metabolizing enzyme levels in myocardial tissue of rats in four groups

注：ATP=三磷酸腺苷，AMP=一磷酸腺苷，ACS=酯酰輔酶A合成酶，CACT=肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別 ATP AMP Na+-K+-ATP酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶 ACS CACT A 組 810.8±49.7 171.9±5.8 509.2±23.2 181.1±14.0 164.9±14.9 136.7±12.0 B組 772.4±35.5 129.9±8.1a 496.0±39.6 144.3±10.7a 135.2±7.3a 114.6±6.1a C組 684.7±87.3ab141.4±14.3a 371.5±81.7a 140.4±32.5a183.7±29.1b123.6±12.2 D 組 602.5±66.8abc168.8±8.3bc 412.3±25.2ab 163.6±8.2c 177.0±6.0b 125.7±8.2 F值 18.676 27.317 11.200 5.928 9.530 4.999 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.002 0.005 0.004 0.012

圖4 四組大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)（×5 000）Figure 4 Mitochondrial ultrastructure of rats in four groups

3 討論

本研究通過構(gòu)建冠心病血瘀證形成過程的動(dòng)物模型模擬冠心病血瘀證形成的過程，進(jìn)而研究能量代謝酶的變化，這對(duì)血瘀證狀態(tài)下冠心病心肌細(xì)胞代謝機(jī)制的探索以及揭示心肌損傷修復(fù)和治療機(jī)制具有重要的意義。

3.1 冠心病血瘀證形成過程中腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）參與調(diào)控的能量代謝過程線粒體是細(xì)胞的供能中心，當(dāng)機(jī)體內(nèi)能量代謝發(fā)生紊亂時(shí)，ATP水平最先受到影響。AMPK被稱為細(xì)胞能量感受器，其活性主要受AMP/ATP調(diào)節(jié)。在低氧、缺血等條件下，細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP升高，AMPK易被激活［6］。本研究結(jié)果顯示，C、D組大鼠心肌組織ATP水平低于A、B組，D組大鼠心肌組織ATP水平低于C組；B、C組大鼠心肌組織AMP水平低于A組，D組大鼠心肌組織AMP水平高于B、C組；提示機(jī)體內(nèi)AMP/ATP比例失調(diào)會(huì)誘發(fā)AMPK的激活。AMPK屬于異源三聚體，由α、β、γ 3個(gè)亞基組成［7-8］。大量研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的下游靶蛋白主要與能量代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，其通過調(diào)控代謝相關(guān)酶而幫助細(xì)胞度過急性損傷期，暫時(shí)保障細(xì)胞的存活［9-12］。AMPK參與機(jī)體能量代謝可以用“開源”“節(jié)流”四個(gè)字來概括，具體表現(xiàn)在糖代謝、脂肪酸代謝、蛋白質(zhì)代謝以及線粒體的生物合成和自噬等方面。心臟能源底物的利用隨機(jī)體生理或病理狀態(tài)的不同處于動(dòng)態(tài)變化中［13］。心肌輕度及中度缺血時(shí)，心肌能量利用的形式主要是糖酵解，同時(shí)脂肪酸的氧化也會(huì)加速［14］；激活的AMPK能夠使更多的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）4易位至肌膜，隨后增加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入［15-17］。同時(shí)AMPK還可以激活糖酵解的關(guān)鍵酶6-磷酸果糖激酶2（PFK2），提高糖酵解的效率，進(jìn)而快速為心肌補(bǔ)償供能［18］。當(dāng)缺血時(shí)間過長或嚴(yán)重缺血時(shí)，GLUT的轉(zhuǎn)移過程受到抑制，葡萄糖攝取減少或中斷，糖原儲(chǔ)存耗竭，另一方面糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸不能徹底被有氧氧化而致乳酸堆積，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸中毒，心肌細(xì)胞受損明顯［14，19］。AMPK的激活被證明可以增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體CD36的轉(zhuǎn)位，從而增加心臟中脂肪酸的利用率［20-21］。AMPK促進(jìn)脂蛋白脂酶（LPL）從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中催化TG轉(zhuǎn)化為脂肪酸［7］。此外，AMPK-乙酰輔酶A羧化酶（ACC）信號(hào)通路在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［22］。激活的AMPK可磷酸化ACC，減少丙二酰輔酶A合成，增加肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT1）的活性，促進(jìn)長鏈酯酰輔酶A從胞質(zhì)進(jìn)入線粒體進(jìn)而催化脂肪酸β-氧化［23-25］，此時(shí)會(huì)增加脂肪酸氧化和ATP產(chǎn)生的速率，故可以滿足心肌的暫時(shí)需求?；罨腁MPK可直接磷酸化過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔活化子1-α（PGC-1α）或與去乙?；福⊿IRT1）調(diào)控PGC-1α活性［26-27］，進(jìn)而促進(jìn)糖酵解和線粒體的生物合成［28］，并抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放，起到保護(hù)線粒體的生物學(xué)功能的作用［29］。此外，KIM等［30］研究表明，AMPK和PGC-1α的升高可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的活性和腫瘤壞死因子（TNF）-α在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥的分解［31］。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine nucleotides，NAD+）依賴的組蛋白去乙?；?，通過降低其底物叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box transcription factor O，F(xiàn)OXO）乙?；蕉せ頑cl-2和生存素，抑制促凋亡因子Bax和Caspase-3，最終減輕心肌缺血性損傷［32-33］。心肌組織的纖維化改變是心肌組織缺血缺氧后發(fā)生重構(gòu)的典型病理改變。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）已經(jīng)被公認(rèn)為是蛋白質(zhì)合成的中心調(diào)解分子，并且其活性被AMPK調(diào)控，AMPK通過磷酸化TSC2抑制下游GTP酶Rheb進(jìn)而調(diào)控mTOR抑制蛋白質(zhì)合成［34-35］，這有利于減少缺血性損傷后心肌肥厚的發(fā)生。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)的合成也受控于AMPK磷酸化真核延伸因子2激酶（eEF2k）的能力，使真核延伸因子2（eEF2）磷酸化并使其失活［36-37］。在下調(diào)蛋白質(zhì)合成的同時(shí)，AMPK還通過直接抑制糖原合成酶和甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）來抑制糖原和TG的產(chǎn)生，避免應(yīng)激狀態(tài)下的多余耗能［38］。過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）γ是核激素受體超家族中的一員，位于AMPK/mTOR信號(hào)通路上，一般參與細(xì)胞生長、蛋白質(zhì)合成以及炎性因子的表達(dá)［39-40］。有研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食大鼠血管內(nèi)皮損傷模型中PPARγ具有明顯減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用［41］。由于AMPK對(duì)mTOR信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，AMPK也與自噬相關(guān)。心肌細(xì)胞自噬通過降解功能異常受損或老化的細(xì)胞器，為細(xì)胞提供能量、促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)以及細(xì)胞的自我更新，以維持心臟功能和細(xì)胞存活［42］。在局部缺血過程中，AMPK抑制mTOR也可以通過磷酸化ULK激酶（ULK1，一種介導(dǎo)自噬的中心蛋白）直接觸發(fā)自噬，進(jìn)而在心肌梗死時(shí)起到對(duì)心臟的保護(hù)作用［43-44］。綜上，AMPK可與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR通路發(fā)揮交互作用，并最終通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、線粒體生物發(fā)生、心肌自噬和抗凋亡途徑而發(fā)揮心肌保護(hù)作用（見圖 5）［45］。

3.2 冠心病血瘀證能量代謝途徑中關(guān)鍵酶的分析 本研究組前期已運(yùn)用“氣相色譜-質(zhì)譜”的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)冠心病血瘀證患者血漿、尿液及模型大鼠的心肌組織、血漿的代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證形成過程中心肌能量代謝變化貫穿始終［14，46］。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶是細(xì)胞膜上一種重要糖蛋白，在信息傳遞、能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及維持細(xì)胞器完整性等多方面發(fā)揮重要的作用，可作為細(xì)胞代謝紊亂的重要指標(biāo)［47-48］。正常情況下，Na+-K+-ATP酶能夠利用ATP釋放的能量將Na+運(yùn)到細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的K+運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。ATP的缺乏使Na+-K+-ATP酶活性受抑制，導(dǎo)致Na+滯留于細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞水腫；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Na+濃度過高會(huì)啟動(dòng)Na+-Ca2+交換，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載不僅有可能會(huì)增強(qiáng)心肌收縮力，引發(fā)心力衰竭，還會(huì)破壞線粒體功能，導(dǎo)致能量合成障礙，細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞外K+濃度過高，細(xì)胞興奮性增強(qiáng)，可能會(huì)導(dǎo)致心律失常。本研究結(jié)果顯示，B組大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶水平低于A組；C組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平低于A組；D組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶水平低于A、B組，Ca2+-Mg2+-ATP酶水平高于C組；表明冠心病血瘀證慢性心肌缺血模型逐步形成的過程中，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平在亞血瘀證期下降明顯，但在心血瘀阻證期Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平較前有所上升，這可能與心肌缺血應(yīng)激狀態(tài)下AMPK通路的激活有關(guān)，AMPK通路的激活會(huì)激活促使線粒體生物發(fā)生的分子，例如PGC-1α，進(jìn)而恢復(fù)心肌細(xì)胞功能。心肌缺血狀態(tài)下，AMPK激活除了調(diào)節(jié)糖代謝外，還通過調(diào)動(dòng)游離脂肪酸β-氧化途徑為心肌組織緊急供能，而長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體必須借助CACT轉(zhuǎn)運(yùn)，才能形成乙酰輔酶A并經(jīng)過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP［49］。當(dāng)脂肪酸借助CACT進(jìn)入線粒體內(nèi)膜后，還需在催化脂肪酸活化的關(guān)鍵酶ACS幫助下進(jìn)行β-氧化完成供能使命。本研究結(jié)果顯示，B組大鼠心肌組織ACS、CACT水平低于A組；C組大鼠心肌組織ACS水平高于B組；D組大鼠心肌組織ACS水平高于B組；表明血瘀證前期ACS、CACT水平有所降低，但在亞血瘀證期和血瘀證期ACS水平逐漸升高，這可能與AMPK通路激活后促使游離脂肪酸氧化增強(qiáng)，ACS及CACT利用度增加有關(guān)，這也與另一篇文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果［14］一致。冠心病是慢性病中的頭號(hào)殺手，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于其形成過程中能量代謝變化進(jìn)行了初步探究，然而其變化背后的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入挖掘，這對(duì)于慢性病的早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)具有重要的指示意義。

圖5 激活的AMPK潛在下游分子信號(hào)通路在心肌保護(hù)中的作用Figure 5 The role of activated AMPK potential downstream molecular signaling pathways in myocardial protection

3.3 本研究局限性 本研究尚存在一定局限性：（1）本研究納入樣本量相對(duì)較小，結(jié)果可能存在一定偏倚，需要在后續(xù)的研究中擴(kuò)大樣本量；（2）由于課題經(jīng)費(fèi)有限，本研究雖進(jìn)一步證實(shí)了冠心病血瘀證形成過程中心肌能量代謝酶類水平差異性改變，但沒有進(jìn)行深層次的分子機(jī)制探究，這有待于在今后的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步完善。

綜上所述，心肌細(xì)胞能量代謝酶參與冠心病血瘀證形成的整個(gè)過程。參與代謝相關(guān)的酶類中ATP與AMP水平變化最為關(guān)鍵，這將是AMPK通路發(fā)揮應(yīng)激性心肌保護(hù)作用的重要信號(hào)，同時(shí)AMPK通路的激活很可能是觸發(fā)心肌細(xì)胞能量代謝其他酶類變化的上游效應(yīng)分子。

作者貢獻(xiàn)：周曼麗進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；俞赟豐、馮宇進(jìn)行論文的修訂、英文的修訂；簡維雄負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。