黃小強(qiáng) ，朱懷昌 ，許 文 ，吳水生 ，黃 濤 ，賈 安 *

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種常見的臨床綜合癥，其致傷因素主要分為間接因素和直接因素（包括機(jī)械因素、化學(xué)因素、生物因素）導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸功能不全或呼吸衰竭癥狀，具有較高的發(fā)病率和病死率［1-2］，研究統(tǒng)計(jì) ALI 致死率高達(dá) 30%～50%［3］。 目前，臨床上常用機(jī)械通氣、激素和抗炎藥物治療，但存在著明顯缺陷，如條件限制、難以推廣、藥物毒副作用明顯、預(yù)后差等［4］，因此開發(fā)一種安全有效的防治ALI 藥物尤為迫切。

澤瀉來源于澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉［Alisma orientale （Sam.） Juzep.］的干燥塊莖，其性寒，味甘，具有利濕、清熱、化濁降脂等功效［5-6］，主產(chǎn)于福建、江西、四川等地，其中福建產(chǎn)澤瀉最為優(yōu)質(zhì)，為福建著名道地藥材。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：澤瀉具有抗炎、利尿、降血糖、調(diào)節(jié)血脂等藥理作用［7-10］。研究發(fā)現(xiàn)澤瀉主要化學(xué)成分是三萜類化合物［11］，課題組前期開展了澤瀉總?cè)撇课坏母患兓に囇芯?，得到總萜含量達(dá)到50%以上的三萜部位，同時(shí)課題組通過體內(nèi)和體外炎癥模型證明了澤瀉總?cè)凭哂锌寡鬃饔茫?］，但對(duì) ALI 的研究尚未見報(bào)道。 本研究主要是探究澤瀉總?cè)茖?duì)ALI 的保護(hù)作用，為澤瀉總?cè)品乐蜛LI 的藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Infinite 公司）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FY135 型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；BS-3000A 系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；RM2125 型石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）。

1.2 藥品與試劑 澤瀉飲片購自福建金山醫(yī)藥集團(tuán)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，為澤瀉科植物澤瀉 Alisma orientale（Sam.）Juzep.，樣品寄存在福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。 脂多糖（LPS，美國 Sigma 公司，貨號(hào)：L2630，規(guī)格：10 mg／支）；地塞米松片（廣東南國藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.75 mg／片）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（MPO）活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動(dòng)物 60 只SPF 級(jí) KM 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，使用合格證號(hào)：SYXK（閩）2014-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 21～23℃，相對(duì)濕度55%～75%，明暗各12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方 法

2.1 藥物制備

2.1.1 澤瀉總?cè)频闹苽?參考課題組前期研究澤瀉總?cè)频闹苽浞椒ǎ?1］制備成濃度為2.5、5.0、10.0 mg／mL，即低、中、高 3 種濃度澤瀉總?cè)?，備用?/p>

2.1.2 地塞米松溶液的制備 將地塞米松片研成細(xì)粉末，溶于水中，制備成質(zhì)量濃度0.000 5 g／mL 的溶液，備用。

2.2 分組與給藥 將60 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組，模型組，地塞米松組，澤瀉總?cè)频汀⒅?、高劑量組（簡稱低、中、高劑量組），每組10 只。低、中、高劑量組分別以 25、50、100 mg／kg 澤瀉總?cè)乒辔?，地塞米松組以5 mg／kg 地塞米松進(jìn)行灌胃，正常組和模型組予等量常溫生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)給藥14 d。 末次給藥后2 h，剔除小鼠頸部正中毛發(fā)，酒精消毒，正中切開頸部皮膚，深度約2 cm，暴露并分離氣管，采用樣品進(jìn)樣器于氣管內(nèi)慢慢滴注 LPS 生理鹽水溶液（0.5 mL／kg），正常組采用同樣方法給予相應(yīng)體積的生理鹽水，滴注結(jié)束后消毒并縫合皮膚［12］。 禁食不禁水，造模12 h后，小鼠眼眶采血，隨后處死小鼠，迅速取出小鼠的肺組織，備用。

2.3 小鼠肺組織濕／干重比值（W／D）測(cè)定 參考文獻(xiàn)［13］，取右肺上葉，除去結(jié)締組織，用濾紙吸干表面水分和血液，稱量得到肺組織濕重；隨后將肺組織放置在80 ℃恒溫干燥箱中連續(xù)干燥48 h 以上，稱量肺組織干重并記錄，計(jì)算（W／D）：

W／D＝肺組織濕重／肺組織干重×100%

2.4 小鼠肺組織中MPO 活性測(cè)定 取適量小鼠肺組織于組織勻漿器中，加生理鹽水并在冰水浴中進(jìn)行研磨，離心得上清液，按照MPO 試劑盒說明書檢測(cè)肺組織中MPO 活性。

2.5 小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量測(cè)定

取血液樣本，3 000 r／min 離心 10 min，取上清，按照試劑盒說明書步驟，采用ELISA 法測(cè)定小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量。

2.6 肺組織病理學(xué)檢查 取右肺下葉固定于10%中性甲醛溶液中，24 h 后取出，使用蒸餾水沖洗至無味；然后對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片，在顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)觀察，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［14］，包括肺泡壁厚度、 肺組織破壞和炎癥細(xì)胞浸潤，每個(gè)指標(biāo)按5 分制評(píng)分：0 分為最小損傷，1 分為輕度損傷，2 分為中度損傷，3 分為重度損傷，4 分為最大損傷。 肺損傷評(píng)分為3 個(gè)指標(biāo)評(píng)分之和。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠肺組織W／D 比較 見表1。

表1 各組小鼠肺組織 W／D 比較（±s）

表1 各組小鼠肺組織 W／D 比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

W／D 3.76±0.60 5.94±0.501）4.05±0.493）5.78±0.37 5.26±0.592）4.10±0.623）組別正 常 組模 型 組地塞米松組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10

3.2 各組小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺組織中MPO 活性比較 見表2。

表2 各組小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺組織中 MPO 活性比較（±s）

表2 各組小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺組織中 MPO 活性比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正 常 組模 型 組地塞米松組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10 TNF-α／（pg／mL）241.28±57.47 682.32±113.891）426.68±89.903）636.11±109.70 558.40±100.242）531.05±81.173）IL-6／（pg／mL）59.33±18.06 212.45±45.201）103.98±20.553）177.94±24.902）163.23±38.512）150.77±32.113）IL-1β／（pg／mL）77.43±12.16 316.45±39.051）183.97±31.643）287.94±25.63 273.23±36.792）260.77±24.333）MPO ／（U／g）2.42±0.59 5.72±0.701）4.51±0.693）5.41±0.68 5.07±0.542）4.83±0.523）

3.3 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)和肺損傷評(píng)分比較 見圖1、圖2。

4 討 論

ALI 是臨床常見的一種嚴(yán)重疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)生迅速，死亡率高［15］。革蘭陰性菌感染導(dǎo)致肺炎時(shí)是ALI 最常見的誘導(dǎo)因素，LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的一種成分，同時(shí)也是主要致病物質(zhì)［16］。LPS 刺激能夠活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體釋放大量TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎癥因子，進(jìn)而引發(fā)急性炎癥［17］。雖然目前關(guān)于ALI 的致病機(jī)制尚不清楚，但是大量研究報(bào)道認(rèn)為，肺組織的炎癥反應(yīng)失衡是導(dǎo)致ALI 發(fā)生的根本原因［18］。地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素，具有強(qiáng)大的抗炎、抗過敏作用，可較好地減輕由ALI 所致的肺損傷［19］，因此本研究以地塞米松為陽性對(duì)照。 本研究結(jié)果顯示澤瀉總?cè)颇軌蝻@著性降低 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 炎癥因子，提示澤瀉總?cè)票Ｗo(hù)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷與抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

肺組織的 W ／D 可反映肺水腫程度［20］。 本研究結(jié)果顯示澤瀉總?cè)颇軌蝻@著降低W／D，減輕LPS所誘導(dǎo)的ALI。 此外，本研究結(jié)果顯示模型組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重，可見彌漫性肺水腫，肺泡壁和肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤，而給予澤瀉總?cè)坪笊鲜霾±碜兓黠@減輕。

總之，澤瀉總?cè)颇軌蚪档蚖／D 和MPO 活性，同時(shí)也能夠降低血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 炎癥因子含量，提示澤瀉總?cè)茖?duì)LPS 所致的急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與澤瀉總?cè)埔种萍?xì)胞炎癥因子分泌有關(guān)。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)光鏡圖（×200）

圖2 各組大鼠肺損傷評(píng)分柱狀圖