李曉軍，馬躍英，郭躍東，王海霞，馮 謙，邢會(huì)霞，馬曉紅，李康寧，黃少磊， 劉彥民

（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

“金雙歧” 是內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司主導(dǎo)產(chǎn)品，是內(nèi)蒙古自治區(qū)成立70 年來，企業(yè)自主研發(fā)并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的唯一一個(gè)國家一類新生物制品，其療效確切，安全無毒副作用。金雙歧所含3 種菌粉，長雙歧桿菌菌粉、保加利亞乳桿菌菌粉、嗜熱鏈球菌菌粉均為公司自行研制生產(chǎn)。隨著 “金雙歧” 銷量的逐年遞增，金雙歧中3 種菌粉的生產(chǎn)需求量也隨之增加，菌粉的產(chǎn)能由菌粉活菌數(shù)決定，而3 種菌粉中，保加利亞乳桿菌由于真空冷凍干燥后的菌體存活率比較低，導(dǎo)致菌粉活菌數(shù)相對(duì)較低，產(chǎn)能較其他菌粉落后。因此，將對(duì)保加利亞乳桿菌菌粉活菌數(shù)開展優(yōu)化研究。大部分研究人員通過尋找最適的高密度培養(yǎng)方法來提高保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)，從而提高菌粉活菌數(shù)，或者通過優(yōu)化保護(hù)劑配方來提高菌粉活菌數(shù)，亦或是兩者相結(jié)合的方式[1-4]。都容易忽視發(fā)酵工藝對(duì)保加利亞乳桿菌抗凍性的重要影響，其中保加利亞乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分與其在冷凍干燥過程中的存活率有著十分密切的聯(lián)系[5-8]。培養(yǎng)基組分中碳氮源是最主要的影響因素，選擇合適的碳氮源可增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而增加菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使得菌體的抗凍性得到提高[9]。另外，不同碳氮源會(huì)影響菌體的形態(tài)，形態(tài)的改變也會(huì)引起抗凍性的改變[10]。以保加利亞乳桿菌為出發(fā)菌株，通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出顯著影響真空冷凍干燥后菌體細(xì)胞存活率的氮源物質(zhì)，然后利用響應(yīng)面方法優(yōu)化所選有機(jī)氮源的復(fù)配比例，以期得到可提高凍干存活率的最優(yōu)氮源組合。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 供試菌種保加利亞乳桿菌NQ2508，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司技術(shù)中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS 培養(yǎng)基：酪蛋白胨4 g，牛肉膏8 g，葡萄糖12 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000 mL，pH 值6.6。

MRS 檢測(cè)培養(yǎng)基：在以上改良MRS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂粉15 g。

凍干保護(hù)劑配方：脫脂乳200 g，乳糖12 g，谷氨酸鈉10 g，抗壞血酸10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

牛肉膏、牛肉浸粉、酵母粉、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨，榮氏生物制品（蘇州） 有限公司提供。

1.1.4 儀器及設(shè)備

J2-21 型離心機(jī)、BCN-1360 型超凈臺(tái)、1029 型厭氧培養(yǎng)箱、 2014-025Bb 型真空冷凍干燥機(jī)、PB-10 型酸度計(jì)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)及凍干

將保加利亞乳桿菌菌種在MRS 液體培養(yǎng)基中活化2 代后，按5%的接種量分別接種于含不同氮源物質(zhì)的MRS 培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱于37 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期時(shí)，各發(fā)酵液于4 ℃下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，離心得到的菌體以2 倍質(zhì)量的保護(hù)劑懸浮，然后進(jìn)行真空冷凍干燥（預(yù)凍：-40 ℃，2 h；升華干燥：-30～-8 ℃，8 h；解析干燥：8～25 ℃，4 h）。得到的凍干粉進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè)，并計(jì)算菌體凍干存活率。菌體凍干存活率的計(jì)算方法為：

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以保加利亞乳桿菌真空冷凍干燥后菌體凍干存活率為響應(yīng)值，首先利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法從各氮源物質(zhì)因素中篩選出顯著影響因素，再利用響應(yīng)面方法（RSM） 中的Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)氮源物質(zhì)組成，并進(jìn)行驗(yàn)證。用Design Expert 8.0 軟件作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析的軟件工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著影響因素

選定N=12 的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酪蛋白胨、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等6 個(gè)因素進(jìn)行顯著性影響因子篩選，各因素均取2 個(gè)水平：高水平 “+” 和低水平 “-”。

Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平見表1，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的方差分析見表3。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的方差分析

由表3 的方差分析可以看出，對(duì)保加利亞乳桿菌凍干存活率有顯著影響的氮源依次是酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉，其他因素均不顯著。這3 個(gè)因素的估計(jì)系數(shù)均為正值，說明試驗(yàn)中所定的這3 種氮源質(zhì)量濃度有些偏低，下一步優(yōu)化中應(yīng)適當(dāng)?shù)靥岣邼舛取?/p>

2.2 Box-Behnken 優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

選用三因素三水平， 17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken 設(shè)計(jì)，其中5 個(gè)為中心點(diǎn)。

Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表4，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

對(duì)表5 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到的二次方程模型為：

Y=90.35+2.56A+6.45B+3.54C+2.37AB-2.64AC-2.16BC-3.86A2-4.92B2-1.16C2.

式中： Y——響應(yīng)值菌體凍干存活率，%；

A，B，C——分別代表酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的添加質(zhì)量濃度，g/mL。

響應(yīng)面回歸方程方差分析見表6。

表6 響應(yīng)面回歸方程方差分析

由表6 可知，多元相關(guān)系數(shù)R2=99.49，說明模型對(duì)實(shí)際情況的擬合度很好。模型項(xiàng)p 值（Prob＞F）＜0.000 1，說明模型顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的F 檢驗(yàn)均極顯著，說明所選擇的酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉3 種因素對(duì)菌體凍干存活率的影響都極顯著；由交互項(xiàng)的F 檢驗(yàn)可知酵母粉與酪蛋白胨、酵母粉與牛肉浸粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉對(duì)菌體凍干存活率影響的交互作用極顯著。

酵母粉和酪蛋白胨對(duì)菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖1，酵母粉和牛肉浸粉對(duì)菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖2，牛肉浸粉和酪蛋白胨對(duì)菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖3。

圖1 ～圖3 是多元回歸方程式所做的等高線圖和響應(yīng)面圖，由此可對(duì)任何兩因素交互影響菌體凍干存活率進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以確定最佳因素水平范圍。通過軟件計(jì)算得到，酵母粉質(zhì)量濃度0.46 g/100 mL，酪蛋白胨質(zhì)量濃度0.52 g/100 mL，牛肉浸粉質(zhì)量濃度0.93 g/100 mL 時(shí)，預(yù)測(cè)菌體凍干存活率最大值為93.75%。以篩選出的最佳質(zhì)量濃度配比，做3 組重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，平均菌體存活率為92.98%，與預(yù)測(cè)值非常接近，說明通過響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

通過Plackett-Burman 試驗(yàn)研究了各種氮源物質(zhì)對(duì)菌體凍干存活率的影響程度，結(jié)果表明酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉對(duì)保加利亞乳桿菌的凍干存活率具有顯著性影響。通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了氮源組成，即當(dāng)酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的質(zhì)量濃度分別為0.46，0.52，0.93 g/100 mL 時(shí)，凍干后保加利亞乳桿菌具有最大存活率為93.75%，實(shí)測(cè)值平均為92.98%，與理論預(yù)測(cè)值較為接近。說明該模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用意義，為保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了良好的基礎(chǔ)。