郭津生 王 滿

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科 上海 200032）

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝臟的一種非實質(zhì)細(xì)胞，在肝纖維化發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。原代分離的HSC 在體外的培養(yǎng)和傳代時間有限，傳代一定次數(shù)后就會進(jìn)入衰老期而不能再繼續(xù)增殖。而反復(fù)分離原代細(xì)胞不僅費時、費力，且各批次細(xì)胞間存在差異，不能保持細(xì)胞生理指標(biāo)的穩(wěn)定性。體外能無限培養(yǎng)的永生化HSC 的建立可為科學(xué)研究提供穩(wěn)定、充足的細(xì)胞材料。建立和改良人HSC 的分離培養(yǎng)方法及獲得永生化人HSC 株對于肝纖維化發(fā)生機(jī)制、診斷及治療研究具有重要意義。

已有通過脂質(zhì)體介導(dǎo)猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）大腫瘤抗原（large tumor antigen，TAg）基因的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得永生化人HSC（LX1 及LX2）的報道［1］。既往研究中，我們采用改良酶液灌注消化及密度梯度離心兩步法從1 例中國兒童肝腫瘤手術(shù)患者的肝臟標(biāo)本中分離HSC［2］，液氮凍存原代細(xì)胞。本研究通過構(gòu)建慢病毒SV40 TAg 表達(dá)質(zhì)粒，介導(dǎo)SV40 TAg 轉(zhuǎn)染該原代HSC，獲得永生化人HSC 株（命名為WM07），可穩(wěn)定傳代并用于肝纖維化研究。

材料和方法

構(gòu)建SV-40 TAg 慢病毒表達(dá)載體

PCR 獲取全長SV40 TAg 序列 以含SV40 TAg cDNA 序列的SV40 tsA58 質(zhì)粒［3-5］為模板，根據(jù)NCBI 的SV40 TAg 完整基因參考序列（NC_001669.1）設(shè)計特定的質(zhì)粒構(gòu)建引物。SV40 TAg-CF：5’-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’；SV40 TAg-CR：5’-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGA-3’。

高保真PCR 獲取SV40 TAg 全長cDNA PCR反應(yīng)體系（50 μL）：引物混合液1.5 μL，10×Pfu DNA 聚合酶反應(yīng)混合物（含dNTP）5 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 質(zhì)粒1 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，68 ℃4 min，36 個循環(huán)；68 ℃5 min；恢復(fù)至4 ℃。

PCR 產(chǎn)物純化 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切割回收SV40 TAg 全長cDNA PCR 條帶，pureLinkRQuickGel（美國Invitrogen 公司）提取純化PCR 產(chǎn)物，測定并調(diào)整為10 ng/μL濃度。

PCR 產(chǎn)物TOPO 克隆進(jìn)入pENTRTMTOPO?載體 純化的SV40 TAg PCR 產(chǎn)物4 μL，鹽溶液1 μL，pENTRTMTOPO?載體（美國Invitrogen 公司）1 μL，總體積6 μL，室溫輕柔混勻，室溫放置30 min，置于冰上。

轉(zhuǎn)化和Entrez 克隆篩選 TOPO?克隆反應(yīng)產(chǎn)物2 μL 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli），接種于卡那霉素LB 瓊脂板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選5 個生長菌落擴(kuò)增和提取質(zhì)粒，以M13 正向和逆向引物進(jìn)行PCR 測序（韓國Macrogen 公司），鑒定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，獲得pENTR-SV40 TAg Entrez質(zhì)粒。

LR重組反應(yīng) 1.5 mL離心管中加入7 μL上述克隆表達(dá)質(zhì)粒pENTR-SV40 TAg（150 ng）、1 μL 目標(biāo)慢病毒載體pLenti4/V5-DEST（美國Invitrogen 公司）、8 μL TE 緩沖液、2 μL LR Clonase?Ⅱenzyme mix，混勻，25 ℃孵育1 h，加入1 μL 蛋白酶K 溶液終止反應(yīng)，混勻后37 ℃孵育10 min。

將SV40 TAg cDNA 克隆到目標(biāo)慢病毒載體轉(zhuǎn)化1 μL LR 反應(yīng)液與50 μL Stbl3TM感受態(tài)細(xì)胞，冰上孵育30 min，42 ℃熱休克30 s，加入250 μL SOC 培養(yǎng)液，37 ℃振搖培養(yǎng)1 h，分別將20 μL 和100 μL 轉(zhuǎn)化液鋪于氨芐青霉素LB（LBA）瓊脂板。37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選5 個生長菌落擴(kuò)增和提取質(zhì)粒。以CMV 正向和逆向引物進(jìn)行PCR 測序（韓國Macrogen 公司），鑒定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，構(gòu)建SV40 TAg 慢病毒表達(dá)載體pLenti4/V5-GW/SV40 TAg。

慢病毒包裝采用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000介導(dǎo)pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒質(zhì)粒（假病毒）和包裝質(zhì)粒pCMV-VSV-G 及psPAX2（2∶1.5∶1）轉(zhuǎn)染工程細(xì)胞293FT，進(jìn)行假病毒包裝，24、48、72 h 分別收集含包裝病毒的培養(yǎng)上清液，離心，凍存?zhèn)溆谩?/p>

HSC 分離和原代培養(yǎng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院外科手術(shù)切除人肝臟腫瘤標(biāo)本，無菌操作切取病灶周圍相對正常的一小塊肝組織，按5 mL/g 用EGTA 液（含肝素20 U/mL）沿血管殘端反復(fù)灌注沖洗殘余血液，至肝組織呈灰黃色。采用改良酶液灌注消化及Nycodenz 密度梯度離心兩步法獲得原代HSC［2］。采用常規(guī)臺盼藍(lán)拒染法鑒定細(xì)胞活力。采用自發(fā)藍(lán)綠色熒光、油紅O 脂滴染色、α-平滑肌肌動蛋白（α-smα-SMA）、免疫熒光染色等方法鑒定細(xì)胞純度［2］，每3 天換液1 次，原代凍存。

永生化HSC 株WM07 的建立

SV40 TAg 轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 以含SV40 TAg 的慢病毒培養(yǎng)上清液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染原代（復(fù)蘇第2 代）培養(yǎng)細(xì)胞，48 h 后換用含50 μg/mL 博來霉素（zeocin）的10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液篩選轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)SV40 TAg的原代細(xì)胞，每3天換液1 次，2～4 周后可篩選出存活細(xì)胞克隆，擴(kuò)增成株。細(xì)胞株至少能穩(wěn)定傳十代。

SV40 TAg 表達(dá)的檢測 一抗采用抗SV40 TAg 抗體（1∶200，美國Santa Cruz 公司，sc-148），用Alexa Fluor 594（紅色）標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色，檢測SV40 TAg，可作為SV40 TAg 轉(zhuǎn)染獲得永生化細(xì)胞的標(biāo)志。

α-SMA 的檢測 一抗采用抗α-SMA（1∶500，英國Abcam 公司，ab5694），用Alexa Fluor 488（綠色）標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色檢測α-SMA，作為活化HSC 的標(biāo)志。

結(jié)果

SV40 TAg 全長cDNA 的鑒定高保真PCR 獲取的SV40 TAg 全長cDNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR 條帶大小符合全長SV40 TAg cDNA 片段大?。? 477 bp，圖1）。

圖1 高保真PCR 獲取SV40 TAg 全長cDNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis map showing a single band of high-fidelity PCR product of SV40 TAg full-length cDNA fragment

pENTR-SV40 TAg Entrez 質(zhì)粒的鑒定通過M13 正向引物對pENTR-SV40 TAg Entrez 質(zhì)粒進(jìn)行PCR 測序，結(jié)果驗證所構(gòu)建的pENTR-SV40 TAg Entrez 質(zhì)粒含CACC 克隆位點（122～125）、ATG 轉(zhuǎn)錄起始位點（126～128）及SV40 TAg cDNA序列（圖2）。

慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 的鑒定通過CMV 正向引物對pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR 測序，結(jié)果驗證所構(gòu)建的質(zhì)粒含ATG 轉(zhuǎn)錄起始位點（151～153）及SV40 TAg cDNA 序列（圖3）。

永生化HSC 株WM07 表達(dá)>SV40 Tag對經(jīng)慢病毒介導(dǎo)SV40 TAg 轉(zhuǎn)染、博來霉素篩選獲得的永生化肝星狀細(xì)胞株WM07 進(jìn)行SV40 TAg 的免疫熒光染色，結(jié)果顯示W(wǎng)M07 表達(dá)SV40 TAg，并在細(xì)胞核表達(dá)和定位（圖4）。

永生化HSC 株WM07 表達(dá)活化HSC 標(biāo)志物免疫熒光染色鑒定顯示，WM07 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均表達(dá)活化HSC 的特異性標(biāo)志α-SMA（圖5）。

討論

圖2 M13 正向引物對pENTR-SV40 TAg Entrez 質(zhì)粒進(jìn)行PCR 測序的結(jié)果Fig 2 The PCR sequencing result of pENTR-SV40 TAg Entrez plasmid by M13 forward primer

圖3 CMV 正向引物對pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR 測序結(jié)果Fig 3 PCR sequencing result of the expression plasmid of pLenti4/v5-GW/SV40 TAg lentivirus with CMV forward primer

圖4 免疫熒光染色永生化HSC 株WM07 的SV40 TAg 表達(dá)（×100）Fig 4 Immunofluorescence staining of SV40 TAg expression in theimmortalized HSC line WM07（×100）

圖5 免疫熒光染色永生化人HSC 株WM07 的α-SMA 的表達(dá)（×20）Fig 5 Immunofluorescence staining of α-SMA expression in immortalized human HSC line WM07（×20）

一些抑癌基因p53 和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人體細(xì)胞獲得永生化的必要條件。哺乳動物細(xì)胞使用幾種方法誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，包括使用SV40TAg基因、人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因、P53 和pRB 的小發(fā)卡或短發(fā)卡RNA（shRNA）等。SV40 TAg 是由SV40 病毒早期編碼區(qū)編碼的一種多功能磷酸蛋白，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。SV40 TAg 具有活化宿主細(xì)胞核糖體基因、誘導(dǎo)DNA 合成、修飾蛋白質(zhì)合成起始因子等作用，并且能結(jié)合、調(diào)控某些關(guān)鍵性的細(xì)胞調(diào)控蛋白，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白家族成員（如pRB）、腫瘤抑制因子P53 等，并可誘導(dǎo)感染細(xì)胞的端粒酶活性，誘導(dǎo)多種細(xì)胞的永生化。SV40TAg基因與宿主細(xì)胞DNA穩(wěn)定整合重組后，不但能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SV40 TAg，加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率，同時也能保留原始細(xì)胞的許多分化表型，具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中非原始基因的表達(dá)很少見。

目前已有一些方法用于介導(dǎo)SV40 TAg 轉(zhuǎn)染，如通過脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建有SV40TAg基因的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染目標(biāo)原代細(xì)胞，并篩選獲得永生化細(xì)胞系的方法，但其轉(zhuǎn)染效率較低，篩選困難，一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞難以獲得穩(wěn)定表達(dá)和建立細(xì)胞系。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，能夠?qū)谢驅(qū)胍恍┹^難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)，可以有效感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，并且將靶基因隨機(jī)整合到宿主HSC 基因組中，從而大大增加了感染效率，并且能夠在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)若干代，可以進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選。慢病毒已廣泛用于基因功能研究、RNA干擾、小分子RNA 研究及活體動物實驗中，成為基因治療的有力工具之一。既往研究中，我們采用慢病毒載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染方法成功進(jìn)行了Toll 樣受體4及DDX5 單核苷酸基因多態(tài)性的表達(dá)和功能探討［7-8］。本研究構(gòu)建一種能夠高效、快速轉(zhuǎn)染SV40 TAg 慢病毒的表達(dá)載體，該載體通過工程細(xì)胞包裝可獲得表達(dá)SV40 TAg 的慢病毒顆粒（假病毒）用于轉(zhuǎn)染原代人HSC，進(jìn)而通過博來霉素抗性特點篩選獲得永生化細(xì)胞株。提供一種構(gòu)建永生化細(xì)胞株的方法，并獲得一株永生化HSC 株WM07，可穩(wěn)定傳代，并可用于肝纖維化研究，具有重要的應(yīng)用價值。

致謝美國紐約西奈山肝病中心Scott L.Friedman 教授給予指導(dǎo)和幫助。