劉 娜 薛 揚 唐 杰 張苗怡 任 雪 付建輝

（復旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內科 上海 200040）

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）導致了全球25% 的卒中及45% 的癡呆病例，嚴重增加社會醫(yī)療負擔［1］。散發(fā)性CSVD 的主要危險因素為年齡及高血壓［2］。因此，目前CSVD動物模型主要基于高血壓動物模型。以血管壁增厚、內徑減小為特征的小血管重構是CSVD 最重要的病理表現(xiàn)，而血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在血管重構中起重要作用。VSMCs 是一種可塑性極強的細胞，具有收縮型及合成型兩種表型［3］。在生理狀態(tài)下，VSMCs 表現(xiàn)為收縮表型，維持血管正常收縮舒張功能。然而在病理狀態(tài)下（包括血管受損，高血壓），VSMCs 可由收縮型轉換為合成型，表現(xiàn)為細胞合成、分泌功能旺盛，血管壁基質因而增加，導致血管重構發(fā)生。VSMCs收縮型標志包括α-平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，αSMA），平滑肌22α 蛋白（smooth muscle 22 alpha，SM22α）等［4-5］。細絲蛋白a（filamin a，F(xiàn)LNa）是一種重要的細胞骨架蛋白［6］，有研究發(fā)現(xiàn)FLNa 的增加提示平滑肌細胞由收縮型向合成型轉換［7-9］。目前，大血管疾病的研究提示VSMCs 從收縮型轉換為合成型在高血壓導致的大血管重構中起重要作用［10］。然而，在CSVD 的研究中，腦小動脈管壁VSMCs 表型變化的研究仍然較少。

本文擬采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRsp）對CSVD 病程中腦小血管管壁VSMCs 表型標志的改變進行研究。RHRsp 是由國內學者主創(chuàng)的一種通過雙腎雙夾手術產(chǎn)生穩(wěn)定的高血壓表型的動物模型［11］。RHRsp 表現(xiàn)腦小血管管壁增厚、內徑減小等血管重構表型，是一種相對理想的CSVD 動物模型。同時，小靜脈病變也是CSVD 的重要病理表現(xiàn)之一，雖然早在1995 年Moody 等［12］就曾報道腦靜脈血管壁基質的沉積，提出“腦室周圍靜脈膠原病”一詞。但對于腦小靜脈病變與高血壓的關系目前研究仍然較少。因此本研究同時也觀察RHRsp 在高血壓下腦小靜脈的重構表現(xiàn)。

材料和方法

實驗動物12 只雄性SD 大鼠（70～90 g）購自北京維通利華實驗動物公司，隨機均分為RHRsp 組及假手術組，所有動物均飼養(yǎng)于復旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所。

RHRsp 模型制作對RHRsp 組大鼠使用U 型銀夾縮窄雙側腎動脈［11］，假手術組（正常對照組）行相同開腹及分離腎動脈操作但不鉗夾腎動脈。術后8 周，使用尾動脈血壓計測定大鼠收縮壓。

腦組織取材及冰凍切片制作兩組大鼠均正常飼養(yǎng)至術后7 個月。實驗終點，以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)等滲鹽水、4%多聚甲醛依次心臟灌流后，取腦組織繼續(xù)后固定于4%多聚甲醛中4～6 h。隨后進行梯度蔗糖脫水，OCT 包埋，制作10 μm 冰凍切片。切片選擇層面為前囟前3.0 mm（前囟+3.0 mm）、前囟后0.24 mm（前囟-0.24 mm）及前囟后3.0 mm（前囟-3.0 mm）。

腦組織冰凍切片免疫熒光取冰凍切片室溫復溫后，使用0.25% 的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）破膜15 min。5%的山羊血清（武漢博士德生物工程有限公司）室溫封閉1 h 后一抗4 ℃孵育過夜。使用一抗包括：抗αSMA 抗體（美國Sigma-Aldrich 公司），抗FLNa 抗體（上海碧云天生物技術有限公司），抗SM22α 抗體，抗Ⅳ型膠原蛋白（collagen Ⅳ，COL4）抗體，抗層粘連蛋白抗體（laminin，LN）均購自英國Abcam 公司。隨后對應二抗（Alexa Fluor cy3 二抗及488-conjugated 二抗，1∶1 000，美國Invitrogen Carlsbad 公司）室溫孵育1 h。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，熒光顯微鏡下觀察拍片。每只大鼠選取3 張不同層面腦組織切片，每個層面在皮層、基底節(jié)、海馬、丘腦等不同腦區(qū)隨機拍攝至少3 個視野。拍攝選取10×物鏡，同一觀察指標在同一曝光時間、背景校正參數(shù)下進行拍攝，拍攝圖像分辨率為1 600×1 200。選取內徑為10～65 μm 的腦小血管進行分析，有連續(xù)的αSMA 表達的血管視為小動脈，否則為小靜脈。使用Image J（V1.8.0）軟件在圖像中選擇目標血管，并獲取目標血管各參數(shù)的熒光值進行統(tǒng)計分析。

統(tǒng)計學分析應用SPSS 24.0 軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以表示。各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗后，方差齊的兩組采用t檢驗，方差不齊的兩組行Welch’st檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

血壓測量結果雙腎雙夾術后2 個月測量大鼠尾動脈收縮壓，RHRsp 組血壓顯著高于假手術組［（196.5±9.07）mmHgvs.（121.3±8.19）mmHg，t=15.06，P＜0.000 1，圖1，1 mmHg=0.133 kPa，下同］。實驗終點前，雙腎雙夾術后7 個月重新測量大鼠尾動脈血壓，RHRsp 組血壓仍然維持較高水平［（206.3±7.6）mmHgvs.（122.5±3.94）mmHg，t=23.99，P＜0.000 1，圖1］。

圖1 大鼠尾動脈收縮壓Fig 1 Systolic blood pressure of rats

腦小動脈血管壁平滑肌細胞表型標志表達情況與假手術組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小動脈平滑肌細胞收縮型標志αSMA、SM22α 表達均顯著增高。同時RHRsp 大鼠腦小動脈平滑肌細胞合成型標志FLNa 亦顯著高于假手術組（表1、圖2）。

圖2 大鼠腦小動脈平滑肌細胞表型標志表達情況Fig 2 Phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats

表1 大鼠腦小動脈平滑肌細胞表型標志表達情況Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

表1 大鼠腦小動脈平滑肌細胞表型標志表達情況Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；αSMA：α smooth muscle actin；SM22α，smooth muscle 22 alpha；FLNa：Filamin a.

腦小動脈血管壁LN 及COL4 表達情況細胞外基質是血管壁結構和功能完整性的重要組成部分。其中COL4 以及LN 是血管壁細胞外基質的兩大重要組成成分。VSMCs 是參與分泌血管壁細胞外基質的重要細胞。我們發(fā)現(xiàn)，與假手術組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小動脈血管壁細胞外基質LN 及COL4 表達均增高，差異有統(tǒng)計學意義（表2、圖3、4）。

腦小靜脈血管壁LN 及COL4 表達情況根據(jù)既往研究報道［13］，我們將直徑在10～60 μm，沒有連續(xù)αSMA 表達的小血管視為小靜脈。與假手術組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小靜脈血管壁LN 及COL4 表達均顯著增高（表2、圖3、4）。

表2 大鼠腦小動脈及腦小靜脈血管壁基質表達情況Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

表2 大鼠腦小動脈及腦小靜脈血管壁基質表達情況Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；COL4：Collagen Ⅳ；LN：Laminin.

討論

本研究中，RHRsp 大鼠在雙腎雙夾術后2 個月開始表現(xiàn)穩(wěn)定的高血壓，術后7 個月的病理檢測發(fā)現(xiàn)RHRsp 大鼠腦小動脈VSMCs 收縮型標志及合成型標志均顯著增加，同時大鼠腦小動脈及小靜脈血管壁基質均顯著增加，表現(xiàn)出管壁增厚，內徑減小的腦小血管病血管重構表現(xiàn)。

圖4 大鼠腦小動脈及腦小靜脈血管壁LN 表達情況Fig 4 The expression of laminin in cerebral small arteries and venules of rats

高血壓是CSVD 的重要危險因素，高血壓大鼠模型被廣泛應用于CSVD 的動物研究。RHRsp 模型建模成功后大鼠可表現(xiàn)長時間持續(xù)的高血壓，適合用于觀察長期慢性高血壓對靶器官的損害［11］。研究報道RHRsp 表現(xiàn)腦小血管管壁增粗，內徑減小等CSVD 病理特征［13］，同樣在本研究中也發(fā)現(xiàn)相似表現(xiàn)，是良好的CSVD 動物模型。

在疾病早期，血管重構可以視為機體對抗病理狀態(tài)的代償反應，但持續(xù)的血管重構將導致血管正常功能的喪失，進而表現(xiàn)為失代償。VSMCs 在血管重構中起重要作用。高血壓狀態(tài)下，剪切力、環(huán)形張力等血流動力學的改變可引起VSMCs 的表型發(fā)生改變。既往研究提示5 月齡自發(fā)性高血壓大鼠［14］以及術后6 個月的RHRsp［13］腦小動脈VSMCs收縮型標志αSMA 表達增加。而本研究發(fā)現(xiàn)，雙腎雙夾術后7 個月的RHRsp 大鼠腦小動脈VSMCs 不僅αSMA 表達上升，其另一重要收縮型標志SM22α表達也顯著增高。SM22α 僅在收縮型VSMCs 中高表達，參與VSMCs 表型轉換中絲狀肌動蛋白的聚合過程，具有高度特異性［15］。與之相反的是，肺動脈高壓疾病中肺小動脈平滑肌細胞收縮型表型標志下降［16］，同時在自發(fā)性高血壓大鼠中腸系膜小動脈也存在αSMA 表達下降［17］。我們猜測實驗結果的不同可能是由于不同組織血管床的特異性或疾病進程的不同導致的。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，術后7個月的RHRsp 大鼠中腦小動脈VSMCs 中的FLNa表達上升。FLNa 是一種在平滑肌細胞豐富表達的細胞骨架蛋白［6］，有研究提示FLNa 在合成型VSMCs 中表達增加［8-9］，同時抑制FLNa 表達可以阻礙VSMCs 向合成型轉換［7］。這些都提示VSMCs中的FLNa 表達上升指示VSMCs 從收縮型向合成型轉換。我們的研究進一步確認了術后7 個月的RHRsp 大鼠中腦小動脈血管壁基質LN 及COL4 表達均顯著增加，提示平滑肌細胞合成、分泌細胞外基質的功能旺盛。因此，我們猜測，在雙腎雙夾術后7 個月，RHRsp 大鼠腦小動脈平滑肌細胞處于活躍增殖及分泌狀態(tài)，導致血管壁厚增粗、內徑減小。CSVD 患者的尸檢研究提示CSVD 終末期病理改變?yōu)檠芷交〉耐呓饧把鼙诨|的增生［18］。事實上，目前大部分的動物模型病理研究均能發(fā)現(xiàn)腦小血管的管壁基質增生，但平滑肌瓦解仍然較少見，提示后續(xù)研究可能需要進一步優(yōu)化動物模型。

此外，本研究進一步證實，在高血壓動物模型中，腦小動脈血管重構同時腦小靜脈也出現(xiàn)顯著血管壁基質增生。既往研究也提示，術后6 個月的RHRsp 表現(xiàn)腦小靜脈管壁膠原沉積增加［13］，本研究也證實，高血壓大鼠腦小靜脈管壁不僅膠原類型的基質沉積增加，其他管壁基質例如LN 也沉積增加。事實上，我們的早期研究亦提示自發(fā)性高血壓大鼠也存在腦小靜脈重構的表現(xiàn)［19］，高血壓作為危險因素與腦小靜脈管壁重構的關系及其中的機制仍需進一步研究，缺氧及低灌注后的氧化應激可能是重要因素［13，20］。目前已有研究提示，白質靜脈病變影響靜脈血回流可能在皮質下微梗死中起重要作用［21］。因此后續(xù)針對CSVD 的研究應該對于腦小靜脈的病變給予同樣的重視。