劉 娜 薛 揚 唐 杰 張苗怡 任 雪 付建輝

（復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 200040）

腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）導(dǎo)致了全球25% 的卒中及45% 的癡呆病例，嚴重增加社會醫(yī)療負擔［1］。散發(fā)性CSVD 的主要危險因素為年齡及高血壓［2］。因此，目前CSVD動物模型主要基于高血壓動物模型。以血管壁增厚、內(nèi)徑減小為特征的小血管重構(gòu)是CSVD 最重要的病理表現(xiàn)，而血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在血管重構(gòu)中起重要作用。VSMCs 是一種可塑性極強的細胞，具有收縮型及合成型兩種表型［3］。在生理狀態(tài)下，VSMCs 表現(xiàn)為收縮表型，維持血管正常收縮舒張功能。然而在病理狀態(tài)下（包括血管受損，高血壓），VSMCs 可由收縮型轉(zhuǎn)換為合成型，表現(xiàn)為細胞合成、分泌功能旺盛，血管壁基質(zhì)因而增加，導(dǎo)致血管重構(gòu)發(fā)生。VSMCs收縮型標志包括α-平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，αSMA），平滑肌22α 蛋白（smooth muscle 22 alpha，SM22α）等［4-5］。細絲蛋白a（filamin a，F(xiàn)LNa）是一種重要的細胞骨架蛋白［6］，有研究發(fā)現(xiàn)FLNa 的增加提示平滑肌細胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換［7-9］。目前，大血管疾病的研究提示VSMCs 從收縮型轉(zhuǎn)換為合成型在高血壓導(dǎo)致的大血管重構(gòu)中起重要作用［10］。然而，在CSVD 的研究中，腦小動脈管壁VSMCs 表型變化的研究仍然較少。

本文擬采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRsp）對CSVD 病程中腦小血管管壁VSMCs 表型標志的改變進行研究。RHRsp 是由國內(nèi)學者主創(chuàng)的一種通過雙腎雙夾手術(shù)產(chǎn)生穩(wěn)定的高血壓表型的動物模型［11］。RHRsp 表現(xiàn)腦小血管管壁增厚、內(nèi)徑減小等血管重構(gòu)表型，是一種相對理想的CSVD 動物模型。同時，小靜脈病變也是CSVD 的重要病理表現(xiàn)之一，雖然早在1995 年Moody 等［12］就曾報道腦靜脈血管壁基質(zhì)的沉積，提出“腦室周圍靜脈膠原病”一詞。但對于腦小靜脈病變與高血壓的關(guān)系目前研究仍然較少。因此本研究同時也觀察RHRsp 在高血壓下腦小靜脈的重構(gòu)表現(xiàn)。

材料和方法

實驗動物12 只雄性SD 大鼠（70～90 g）購自北京維通利華實驗動物公司，隨機均分為RHRsp 組及假手術(shù)組，所有動物均飼養(yǎng)于復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所。

RHRsp 模型制作對RHRsp 組大鼠使用U 型銀夾縮窄雙側(cè)腎動脈［11］，假手術(shù)組（正常對照組）行相同開腹及分離腎動脈操作但不鉗夾腎動脈。術(shù)后8 周，使用尾動脈血壓計測定大鼠收縮壓。

腦組織取材及冰凍切片制作兩組大鼠均正常飼養(yǎng)至術(shù)后7 個月。實驗終點，以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)等滲鹽水、4%多聚甲醛依次心臟灌流后，取腦組織繼續(xù)后固定于4%多聚甲醛中4～6 h。隨后進行梯度蔗糖脫水，OCT 包埋，制作10 μm 冰凍切片。切片選擇層面為前囟前3.0 mm（前囟+3.0 mm）、前囟后0.24 mm（前囟-0.24 mm）及前囟后3.0 mm（前囟-3.0 mm）。

腦組織冰凍切片免疫熒光取冰凍切片室溫復(fù)溫后，使用0.25% 的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）破膜15 min。5%的山羊血清（武漢博士德生物工程有限公司）室溫封閉1 h 后一抗4 ℃孵育過夜。使用一抗包括：抗αSMA 抗體（美國Sigma-Aldrich 公司），抗FLNa 抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），抗SM22α 抗體，抗Ⅳ型膠原蛋白（collagen Ⅳ，COL4）抗體，抗層粘連蛋白抗體（laminin，LN）均購自英國Abcam 公司。隨后對應(yīng)二抗（Alexa Fluor cy3 二抗及488-conjugated 二抗，1∶1 000，美國Invitrogen Carlsbad 公司）室溫孵育1 h。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，熒光顯微鏡下觀察拍片。每只大鼠選取3 張不同層面腦組織切片，每個層面在皮層、基底節(jié)、海馬、丘腦等不同腦區(qū)隨機拍攝至少3 個視野。拍攝選取10×物鏡，同一觀察指標在同一曝光時間、背景校正參數(shù)下進行拍攝，拍攝圖像分辨率為1 600×1 200。選取內(nèi)徑為10～65 μm 的腦小血管進行分析，有連續(xù)的αSMA 表達的血管視為小動脈，否則為小靜脈。使用Image J（V1.8.0）軟件在圖像中選擇目標血管，并獲取目標血管各參數(shù)的熒光值進行統(tǒng)計分析。

統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 24.0 軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以表示。各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗后，方差齊的兩組采用t檢驗，方差不齊的兩組行Welch’st檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

血壓測量結(jié)果雙腎雙夾術(shù)后2 個月測量大鼠尾動脈收縮壓，RHRsp 組血壓顯著高于假手術(shù)組［（196.5±9.07）mmHgvs.（121.3±8.19）mmHg，t=15.06，P＜0.000 1，圖1，1 mmHg=0.133 kPa，下同］。實驗終點前，雙腎雙夾術(shù)后7 個月重新測量大鼠尾動脈血壓，RHRsp 組血壓仍然維持較高水平［（206.3±7.6）mmHgvs.（122.5±3.94）mmHg，t=23.99，P＜0.000 1，圖1］。

圖1 大鼠尾動脈收縮壓Fig 1 Systolic blood pressure of rats

腦小動脈血管壁平滑肌細胞表型標志表達情況與假手術(shù)組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小動脈平滑肌細胞收縮型標志αSMA、SM22α 表達均顯著增高。同時RHRsp 大鼠腦小動脈平滑肌細胞合成型標志FLNa 亦顯著高于假手術(shù)組（表1、圖2）。

圖2 大鼠腦小動脈平滑肌細胞表型標志表達情況Fig 2 Phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats

表1 大鼠腦小動脈平滑肌細胞表型標志表達情況Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

表1 大鼠腦小動脈平滑肌細胞表型標志表達情況Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；αSMA：α smooth muscle actin；SM22α，smooth muscle 22 alpha；FLNa：Filamin a.

腦小動脈血管壁LN 及COL4 表達情況細胞外基質(zhì)是血管壁結(jié)構(gòu)和功能完整性的重要組成部分。其中COL4 以及LN 是血管壁細胞外基質(zhì)的兩大重要組成成分。VSMCs 是參與分泌血管壁細胞外基質(zhì)的重要細胞。我們發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小動脈血管壁細胞外基質(zhì)LN 及COL4 表達均增高，差異有統(tǒng)計學意義（表2、圖3、4）。

腦小靜脈血管壁LN 及COL4 表達情況根據(jù)既往研究報道［13］，我們將直徑在10～60 μm，沒有連續(xù)αSMA 表達的小血管視為小靜脈。與假手術(shù)組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小靜脈血管壁LN 及COL4 表達均顯著增高（表2、圖3、4）。

表2 大鼠腦小動脈及腦小靜脈血管壁基質(zhì)表達情況Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

表2 大鼠腦小動脈及腦小靜脈血管壁基質(zhì)表達情況Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；COL4：Collagen Ⅳ；LN：Laminin.

討論

本研究中，RHRsp 大鼠在雙腎雙夾術(shù)后2 個月開始表現(xiàn)穩(wěn)定的高血壓，術(shù)后7 個月的病理檢測發(fā)現(xiàn)RHRsp 大鼠腦小動脈VSMCs 收縮型標志及合成型標志均顯著增加，同時大鼠腦小動脈及小靜脈血管壁基質(zhì)均顯著增加，表現(xiàn)出管壁增厚，內(nèi)徑減小的腦小血管病血管重構(gòu)表現(xiàn)。

圖4 大鼠腦小動脈及腦小靜脈血管壁LN 表達情況Fig 4 The expression of laminin in cerebral small arteries and venules of rats

高血壓是CSVD 的重要危險因素，高血壓大鼠模型被廣泛應(yīng)用于CSVD 的動物研究。RHRsp 模型建模成功后大鼠可表現(xiàn)長時間持續(xù)的高血壓，適合用于觀察長期慢性高血壓對靶器官的損害［11］。研究報道RHRsp 表現(xiàn)腦小血管管壁增粗，內(nèi)徑減小等CSVD 病理特征［13］，同樣在本研究中也發(fā)現(xiàn)相似表現(xiàn)，是良好的CSVD 動物模型。

在疾病早期，血管重構(gòu)可以視為機體對抗病理狀態(tài)的代償反應(yīng)，但持續(xù)的血管重構(gòu)將導(dǎo)致血管正常功能的喪失，進而表現(xiàn)為失代償。VSMCs 在血管重構(gòu)中起重要作用。高血壓狀態(tài)下，剪切力、環(huán)形張力等血流動力學的改變可引起VSMCs 的表型發(fā)生改變。既往研究提示5 月齡自發(fā)性高血壓大鼠［14］以及術(shù)后6 個月的RHRsp［13］腦小動脈VSMCs收縮型標志αSMA 表達增加。而本研究發(fā)現(xiàn)，雙腎雙夾術(shù)后7 個月的RHRsp 大鼠腦小動脈VSMCs 不僅αSMA 表達上升，其另一重要收縮型標志SM22α表達也顯著增高。SM22α 僅在收縮型VSMCs 中高表達，參與VSMCs 表型轉(zhuǎn)換中絲狀肌動蛋白的聚合過程，具有高度特異性［15］。與之相反的是，肺動脈高壓疾病中肺小動脈平滑肌細胞收縮型表型標志下降［16］，同時在自發(fā)性高血壓大鼠中腸系膜小動脈也存在αSMA 表達下降［17］。我們猜測實驗結(jié)果的不同可能是由于不同組織血管床的特異性或疾病進程的不同導(dǎo)致的。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7個月的RHRsp 大鼠中腦小動脈VSMCs 中的FLNa表達上升。FLNa 是一種在平滑肌細胞豐富表達的細胞骨架蛋白［6］，有研究提示FLNa 在合成型VSMCs 中表達增加［8-9］，同時抑制FLNa 表達可以阻礙VSMCs 向合成型轉(zhuǎn)換［7］。這些都提示VSMCs中的FLNa 表達上升指示VSMCs 從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換。我們的研究進一步確認了術(shù)后7 個月的RHRsp 大鼠中腦小動脈血管壁基質(zhì)LN 及COL4 表達均顯著增加，提示平滑肌細胞合成、分泌細胞外基質(zhì)的功能旺盛。因此，我們猜測，在雙腎雙夾術(shù)后7 個月，RHRsp 大鼠腦小動脈平滑肌細胞處于活躍增殖及分泌狀態(tài)，導(dǎo)致血管壁厚增粗、內(nèi)徑減小。CSVD 患者的尸檢研究提示CSVD 終末期病理改變?yōu)檠芷交〉耐呓饧把鼙诨|(zhì)的增生［18］。事實上，目前大部分的動物模型病理研究均能發(fā)現(xiàn)腦小血管的管壁基質(zhì)增生，但平滑肌瓦解仍然較少見，提示后續(xù)研究可能需要進一步優(yōu)化動物模型。

此外，本研究進一步證實，在高血壓動物模型中，腦小動脈血管重構(gòu)同時腦小靜脈也出現(xiàn)顯著血管壁基質(zhì)增生。既往研究也提示，術(shù)后6 個月的RHRsp 表現(xiàn)腦小靜脈管壁膠原沉積增加［13］，本研究也證實，高血壓大鼠腦小靜脈管壁不僅膠原類型的基質(zhì)沉積增加，其他管壁基質(zhì)例如LN 也沉積增加。事實上，我們的早期研究亦提示自發(fā)性高血壓大鼠也存在腦小靜脈重構(gòu)的表現(xiàn)［19］，高血壓作為危險因素與腦小靜脈管壁重構(gòu)的關(guān)系及其中的機制仍需進一步研究，缺氧及低灌注后的氧化應(yīng)激可能是重要因素［13，20］。目前已有研究提示，白質(zhì)靜脈病變影響靜脈血回流可能在皮質(zhì)下微梗死中起重要作用［21］。因此后續(xù)針對CSVD 的研究應(yīng)該對于腦小靜脈的病變給予同樣的重視。