溫璐華，武瑞娜

(河北富碩農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河北 邢臺 054499)

植物內(nèi)生菌是指在其一生或一生中的某個階段能進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，并且不引起明顯組織變化的真菌或細(xì)菌[1]，主要包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌[2]。植物內(nèi)生菌是一個生態(tài)學(xué)概念，而非分類學(xué)單位[3]。內(nèi)生菌普遍存在于植物組織中，且難以用常規(guī)方法徹底消滅。當(dāng)植物組織進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，這些內(nèi)生菌就容易引起污染。Leifert[4]等認(rèn)為在正常的滅菌條件下，由內(nèi)生菌產(chǎn)生的污染占所有污染源的1/4。污染發(fā)生在培養(yǎng)過程早期，往往導(dǎo)致增殖效率降低，材料生長減緩，玻璃化苗增加，甚至培養(yǎng)失敗。發(fā)生在后期會導(dǎo)致組培苗移栽困難和死亡。此外，污染還會引起培養(yǎng)材料的遺傳物質(zhì)變異[5]。

1 植物內(nèi)生菌污染特性

1.1 內(nèi)生菌污染與表面菌污染的區(qū)別

內(nèi)生菌存在于植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，在外植體接種后的前幾代培養(yǎng)中不易被肉眼察覺[6]。初代培養(yǎng)中，表面細(xì)菌引起的污染通常出現(xiàn)在接種后2～3d，表現(xiàn)為外植體周圍或培養(yǎng)基表面產(chǎn)生明顯的諸如水污狀、油污狀、氣泡，或干縮的呈現(xiàn)紅、黃、乳白等顏色的菌落。接種后3～5d內(nèi)無癥狀，之后的培養(yǎng)過程中不斷出現(xiàn)菌落，就可能是由內(nèi)生菌引起的[7]。湯雪燕[8]等認(rèn)為，內(nèi)生菌造成的污染發(fā)生在接種5d以后，且污染菌從培養(yǎng)基以上部分長起。

1.2 常見內(nèi)生菌污染種類

內(nèi)生細(xì)菌不能被一般的表面消毒方法所清除，隨材料帶入培養(yǎng)過程引起的污染，稱為內(nèi)生細(xì)菌污染[7]。方麗[9]等發(fā)現(xiàn)組培中細(xì)菌污染占52.13%，分屬于9個種，主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)；真菌污染占43.87%，分屬于18個種，其中芽枝霉(Cladosporiumspp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillumspp.)和酵母為主要污染真菌。沈瑞清[10]等發(fā)現(xiàn)污染馬鈴薯組培苗的真菌分屬6屬，至少12種，分別為鐮刀菌屬的5個種，毛霉菌屬的2個種，鏈格孢屬的2個種等。

目前，被鑒定的組培污染內(nèi)生細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)[11]、土壤桿菌屬(Agrobacterium)[12]、葡萄球菌屬(Staphylococcus)[13]、鏈格孢屬(Alternaria)和鐮刀菌屬(Fusarium)[14]等。

1.3 植物內(nèi)生菌的分布規(guī)律

內(nèi)生菌的分布規(guī)律取決于宿主本身及內(nèi)生菌的種類。在不同宿主，以及同一宿主的不同器官的分布均存在著差異[15]。此外，還受植物的種類、環(huán)境和氣候等因素的影響。通常多年生材料攜帶的細(xì)菌數(shù)較多；田間取得的材料細(xì)菌數(shù)較溫室內(nèi)材料多；溫室材料攜帶的細(xì)菌數(shù)較水培材料多；未經(jīng)陽光照射過的材料，較經(jīng)過陽光照射的材料多。[16]選取極幼嫩的胚或幼嫩莖尖等帶菌量較少的材料作為外植體，可減少內(nèi)生菌污染。

2 組培內(nèi)生菌污染的預(yù)防措施

通過外植體選擇、材料預(yù)處理、組培環(huán)境的控制，以及殺菌劑、抗生素的使用等措施，能夠有效降低內(nèi)生菌污染率。

2.1 外植體選擇

生長在土壤中的塊根、塊莖和鱗莖，帶菌量多。表面積相對較大的材料，帶菌量也較多。故應(yīng)盡量選擇幼嫩的莖尖、胚，并選擇清潔環(huán)境下的植物材料作為外植體。

2.2 材料預(yù)處理

2.2.1 采用栽培手段降低材料帶菌量 減少外植體帶菌量的栽培手段主要包括促發(fā)新枝、暗培養(yǎng)和水培等。侯喜林[17]發(fā)現(xiàn)在黑暗條件下黃化培養(yǎng)仙客來實(shí)生苗，能夠消除內(nèi)生菌污染。

2.2.2 用殺菌劑或抗生素對母株進(jìn)行預(yù)處理 采用殺菌劑或抗生素對母株進(jìn)行連續(xù)多日消毒處理，可降低帶菌量。例如，每2～3天噴灑1次消毒液，濃度不宜過高，半個月到1個月之后，可以有效控制母株的內(nèi)生菌量[18]。同時(shí)，為防止內(nèi)生菌產(chǎn)生耐藥性，抗生素和殺菌劑應(yīng)復(fù)合使用。

2.2.3 其他方法 采用特殊的滅菌方法。周俊輝[19]等利用減壓方法，抽去植物組織中的氣體，使消毒劑更易進(jìn)入組織內(nèi)部，增強(qiáng)殺菌效果，污染率相比對照降低43.3%。

采用熱擊處理。宋艷祥[20]等發(fā)現(xiàn)對桉樹組培苗采用40 ℃熱擊處理可有效降低內(nèi)生菌污染率。崔巍[21]等發(fā)現(xiàn)，對毛尖紫萼蘚進(jìn)行40 ℃分段水浴并結(jié)合升汞溶液浸泡能夠有效降低污染，但材料接種后全部死亡。因此，不同外植體材料在采用熱擊消毒方法時(shí)，需要通過試驗(yàn)獲得具體的處理溫度和時(shí)間。

2.3 改變培養(yǎng)基條件

2.3.1 培養(yǎng)基中添加抑菌劑 在培養(yǎng)基中添加抗生素能夠有效防止細(xì)菌污染的發(fā)生。黃俊軒[22]等在北美海棠培養(yǎng)基中添加羧芐青霉素(250mgL-1)+卡那霉素(50mgL-1)，獲得良好的脫菌效果。田永亮[23]等發(fā)現(xiàn)在葡萄培養(yǎng)基中添加40mgL-1四環(huán)素，能夠有效抑制內(nèi)生菌的滋生，且其對不同葡萄品種的抑菌效果不同。李鳳飛[24]等在榆葉梅培養(yǎng)基中混合添加青霉素鈉300mgL-1、鏈霉素100mgL-1，獲得相對較低的污染率。

在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，能夠減少內(nèi)生真菌污染的發(fā)生。許婉芳[25]等研究發(fā)現(xiàn)，在金線蓮培養(yǎng)基中加入50%多菌靈，抑菌率達(dá)100%。李海峰[26]等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加0.5～1.0mgL-1培福朗能夠有效控制蓮瓣蘭胚培養(yǎng)過程中的真菌污染。張立[27]等研究發(fā)現(xiàn)采用濃度80%多福鋅可濕性粉劑800倍液的培養(yǎng)基對降低污染率有良好效果。

2.3.2 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分 內(nèi)生菌生長需要一定的營養(yǎng)條件，通過增加或去除、提高或降低培養(yǎng)基中的某種成分的濃度(鹽分、糖分或者單寧酸等)，創(chuàng)造不適宜的生長環(huán)境，使其無法繼續(xù)發(fā)育而死亡。宋鋒惠[28]等研究發(fā)現(xiàn)，除去阿月渾子培養(yǎng)基中的VB1、VB6、煙酸等有機(jī)成分(保留肌醇)，對細(xì)菌生長有抑制作用，且不影響材料生長增殖。

2.3.3 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pHpH值對細(xì)菌和真菌細(xì)胞內(nèi)酶的活力、細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸和細(xì)胞呼吸等均有很大影響。除歐文氏菌屬之外，大多數(shù)細(xì)菌在pH<4.5環(huán)境下不能生長。因此，可以通過適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，來避免大量的細(xì)菌污染產(chǎn)生。

3 污染發(fā)生后的補(bǔ)救措施

3.1 抗生素在組培細(xì)菌污染中的應(yīng)用

細(xì)菌污染通常表現(xiàn)為：菌落分布在培養(yǎng)基表面，呈現(xiàn)黏液狀或渾濁的水漬狀，甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀，其中以芽孢桿菌引發(fā)的污染最為普遍和嚴(yán)重，菌落乳白色，呈滴形云霧狀[29]。

黃俊軒[22]等以北美海棠為試材，在MS培養(yǎng)基中添加250mgL-1羧芐青霉素和50mgL-1卡那霉素，連續(xù)3次繼代培養(yǎng)，能夠獲得生長穩(wěn)定的脫菌苗。王梅[30]等研究發(fā)現(xiàn)青霉素G濃度為400mgL-1，能夠有效控制‘章姬’草莓苗內(nèi)生菌污染。而李穎[31]等以銀白楊、四倍體刺槐、微型月季和地被菊為材料研究發(fā)現(xiàn)，青霉素對細(xì)菌污染只起到一定抑制作用，并不能殺滅細(xì)菌。

不適宜的抗生素種類對組培苗生長具有負(fù)面作用。任艷[32]等研究發(fā)現(xiàn)，羧卞青霉素對花生組培苗的生長有負(fù)面影響。蔡坤秀[33]等研究發(fā)現(xiàn)，卡那霉素和鏈霉素對蘆筍的生長有明顯的毒害作用。閻志紅[34]等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中分別添加青霉素或乳酸，培養(yǎng)數(shù)代后西瓜組培苗生長生根受到明顯抑制，二者交替使用，能夠降低其對生長的抑制作用。

針對不同內(nèi)生細(xì)菌污染需要根據(jù)細(xì)菌的種類選擇適宜的抗生素，并通過試驗(yàn)確定最小使用濃度，避免抗生素因遇酸、堿或加熱后分解而失去活性，并尋找穩(wěn)定、耐高溫高壓的抑菌劑。

3.2 殺菌劑在組培真菌污染中的應(yīng)用

組培真菌污染通常表現(xiàn)為培養(yǎng)容器內(nèi)出現(xiàn)白色、黑色、綠色等不同顏色的菌絲塊，其中最為常見的是曲霉、毛霉和青霉屬真菌[35]。

常用的殺菌劑有多菌靈、代森錳鋅、百菌清等。李穎[31]等研究發(fā)現(xiàn)，采用3 %多菌靈無菌液浸泡被真菌污染的材料0.5h以上之后接種，能夠消除真菌污染。李云海[36]等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基加入75%代森錳鋅對蓮瓣蘭等地生蘭的組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的真菌污染具有顯著的防治效果。趙雙雙[37]等研究發(fā)現(xiàn)，在種子萌發(fā)階段使用含0.05%多菌靈的培養(yǎng)基，幼苗生長階段使用含0.05%百菌清的培養(yǎng)基，可明顯抑制組培污染。方麗[38]等研究發(fā)現(xiàn)，乙蒜素和鏈土霉素對組培細(xì)菌和真菌有良好的殺滅效果，且乙蒜素耐高溫，可以在配制培養(yǎng)基時(shí)直接添加。

3.3 其他藥劑的使用

其他藥劑包括防腐劑、乙醇、升汞和一些植物提取物等。李穎[31]等研究發(fā)現(xiàn)，采用75%乙醇和0.1%HgCl2處理可以徹底殺滅真菌和細(xì)菌。周蔣陳[39]等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀，能夠抑制鳶尾組培內(nèi)生菌的滋生，且耐高溫高壓，但苯甲酸鈉的使用濃度不應(yīng)超過0.5%，否則會影響組培苗的增殖率。李白[40]等研究發(fā)現(xiàn)生姜、洋蔥、大蒜和苦瓜的食用器官的粗提物對分離的組培污染細(xì)菌有一定的抑制效果，且與抗生素相比，植物源抑菌劑具有低毒、低殘留、對組培苗傷害小等優(yōu)勢。