歐美同學會醫(yī)師協(xié)會肝膽分會；中國研究型醫(yī)院分子診斷醫(yī)學專業(yè)委員會；中國臨床腫瘤學會肝癌專家委員會；中國預防醫(yī)學學會肝膽胰疾病預防

與控制專業(yè)委員會；亞太肝病診療技術聯(lián)盟肝癌專業(yè)委員會

分子生物學診斷技術已廣泛應用于包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、膽管細胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)、混合癌(HCC-CCA)在內的原發(fā)性肝癌(primary liver cancer, PLC)及膽管癌、膽囊癌等原發(fā)于膽系的惡性腫瘤的臨床診斷、療效評估、預后判斷等各個方面。鑒于現(xiàn)有的包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、免疫組化、基因芯片、基因測序在內的諸多實驗手段易受標本采集、保存、核酸提取、測序深度、試劑和儀器質量、結果分析判讀等許多因素的影響，國內外相關學會已相繼出臺部分共識及指南，以推動分子生物學前沿成果在臨床中的應用。為了完善和規(guī)范肝膽腫瘤相關分子生物學診療技術及臨床實踐應用的各個環(huán)節(jié)，進一步提升其臨床效能的發(fā)揮，我們在系統(tǒng)總結臨床及轉化醫(yī)學研究進展的基礎上，結合我國實際，經過多次討論形成了本共識。本共識旨在為肝膽腫瘤的分子診斷提供規(guī)范及建議，并為推廣分子生物學診斷技術的臨床標準化應用奠定基礎。

1 診斷相關的主要分子標志物

1.1 臨床應用的血清學分子標志物

1.1.1 甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質體(AFP-L3) 血清AFP及其異質體AFP-L3是臨床上應用最廣泛和特異性最強的HCC標志物，國內常用于HCC患者的普查、早期診斷、術后監(jiān)測和隨訪?；瘜W發(fā)光免疫、ELISA和電化學發(fā)光法是其臨床常用的檢測方式。對于AFP≥400 ng/ml超過1個月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活動性肝病的患者，應高度考慮HCC，其診斷特異性高達99%，而敏感性僅為17%[1]。對于AFP陰性的患者，要定期檢測和動態(tài)觀察，并要借助影像學檢查或穿刺活檢等手段來明確診斷。AFP-L3在臨床常用親和吸附離心管法檢測。研究顯示,在AFP不升高的情況下，有34.3%的HCC患者，在確診1年前即出現(xiàn)AFP-L3升高。當以10%為AFP-L3的臨界值時，其對早期HCC的檢測敏感性為22%～33%，特異性為93%～94%。對于AFP陰性(<20 ng/ml)HCC患者，AFP-L3的檢測敏感性為12%～21%，特異性為97%～98%[2]。2005年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準將AFP-L3監(jiān)測應用于HCC預警，并把AFP-L3≥10%作為診斷HCC的高特異性指標。

1.1.2 脫-γ-羧基凝血酶原(DCP) DCP是一種不正常的凝血酶原分子。在HCC中，由于癌細胞不能正常合成凝血酶原前體，同時凝血酶原前體羧化不足，從而生成大量的DCP。目前廣泛采用ELISA試劑盒來檢測DCP，亦可采用電化學發(fā)光免疫法檢測DCP。研究發(fā)現(xiàn)，DCP ≥ 40 mAU/ml診斷早期HCC的敏感性和特異性分別為74%和86%。日本指南建議將DCP聯(lián)合AFP、AFP-L3作為HCC早期診斷和篩查的標志物[3]。

1.1.3 糖類抗原19-9 糖類抗原19-9蛋白是一種臨床常用的腫瘤標志物，在正常的膽管、胰腺、胃和結腸上皮細胞中均有表達。上述部位的疾病均能引起糖類抗原19-9表達升高。其常用檢測方法為微粒子酶免法(MEIA)和ELISA。糖類抗原19-9≥37 kU/L時，聯(lián)合影像學診斷CCA的敏感性為77.4%，特異性為84.7%；糖類抗原19-9≥100 kU/L提示CCA患者預后不良[4]；出現(xiàn)梗阻性黃疸癥狀時，糖類抗原19-9診斷特異性降低。膽道引流減黃后，患者糖類抗原19-9仍維持高值，提示CCA可能性大[5]。糖類抗原19-9≥20 kU/L診斷膽囊癌的敏感性為50%，特異性為92.7%[4]。

1.1.4 癌胚抗原 癌胚抗原是一種參與細胞黏附的細胞表面糖蛋白，是結直腸癌的診斷標志，也是肺癌的預后標志物，在健康成人血液中難以檢測到。因其易受吸煙等因素影響，故無法作為CCA的獨立診斷或預后標志物。臨床常用放射免疫檢測或ELISA方法對血清癌胚抗原進行定量。癌胚抗原≥5 ng/ml時，診斷CCA的敏感性為33%，特異性為85%；癌胚抗原≥4 ng/ml時，診斷膽囊癌的敏感性為79.4%，特異性為79.2%[4]。目前傾向推薦腫瘤標志物糖類抗原19-9聯(lián)合癌胚抗原和糖類抗原125，以提高CCA鑒別診斷率[5](其中糖類抗原125≥35 kU/L)。

1.2 臨床應用的病理組織學分子標志物 HCC的組織學分子標志物主要包括肝細胞抗原(HepPar)-1、磷脂酰肌醇聚糖(GPC-3)、精氨酸酶-1、AFP、低分子角蛋白(CK)8和CK18，其中HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和AFP特異性較好，而CK7、CK19是正常小葉間膽管的標志物，因此可作為CCA的標志物。在少數(shù)HCC中，CK19和CK7也可表達，而表達時則提示患者預后不良。在HCC的早期診斷方面，聯(lián)合應用GPC-3、熱休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶具有重要診斷價值，這3個免疫標志物中2項陽性則考慮為HCC。CCA的主要組織學診斷標志物包括CK7、CK19、熱休克蛋白70、黏蛋白-1?；诳乖?抗體免疫反應的免疫病理檢測，并密切結合形態(tài)學，已成為PLC病理診斷與鑒別診斷的常規(guī)手段。

1.3 處于探索階段的血清學分子標志物

1.3.1 高爾基蛋白(GP)73 GP73是上皮細胞特異性的跨膜蛋白，在正常肝臟匯管區(qū)周圍的膽管上皮細胞低表達，在大部分的正常肝細胞中不表達，在肝組織病變時表達上調。HCC患者外周血GP73水平更是明顯升高。臨床上常用ELISA方法檢測GP73。當血清GP73≥10 U/ml(相對值)時，診斷HCC的敏感性為69%，特異性為75%[6]。需要注意的是，GP73并不是一個HCC特異性標志物，它在腎細胞癌、前列腺癌中都有表達。同時，血清GP73升高不顯著時，需與肝硬化相鑒別。

1.3.2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)-3 GPC-3是一種細胞膜表面蛋白聚糖，參與多種細胞生物學過程，可用ELISA或放射免疫法檢測。在乙型肝炎和丙型肝炎患者血清中，GPC-3≥300 ng/ml診斷HCC的敏感性為53%，特異性為77%。在患者HCC組織中，免疫組化檢測GPC-3陽性時，診斷HCC的敏感性為97.7%，特異性為91.3%[7]。

1.3.3 循環(huán)腫瘤細胞DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)突變 ctDNA是腫瘤細胞釋放到外周血中的游離DNA。應用ctDNA的特征性突變結合血清蛋白標志物檢查，可以診斷出卵巢、肝臟、胃、胰腺、食道、結腸、肺或乳腺等8種常見腫瘤[8]，檢出陽性率的中位值為70%，其中HCC的陽性檢出率達到96.1%。在不依賴臨床信息的情況下，上述方法可以鑒定出44% HCC患者，聯(lián)合臨床信息檢出率可達到63%。另一項聯(lián)合了ctDNA檢查的HCC高頻突變與血清中AFP、DCP水平檢測開發(fā)的“HCC篩查系統(tǒng)”，可以從HBsAg陽性的無癥狀慢性乙型肝炎人群中篩查出HCC患者，其診斷敏感性85%，特異性93%，并有助于提前發(fā)現(xiàn)潛在的HCC患者，其診斷敏感性100%，特異性94%[9]。

1.3.4 ctDNA甲基化 DNA甲基化的改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，且這種改變被認為發(fā)生在遺傳學改變之前。外周血ctDNA的甲基化檢測，是近年腫瘤另一種無創(chuàng)早期診斷方法。研究顯示，對組織和外周血樣本差異性甲基化位點結合臨床特征所構建的診斷模型，對于鑒別HCC的敏感性達84.8%，特異性為93.1%，同時有助于預測腫瘤的分期、療效和復發(fā)[10-11]。在2019年歐洲腫瘤內科學年會上公布的一項大樣本多中心臨床試驗顯示，用HCC等20余種腫瘤及健康志愿者外周血甲基化測序后構建的腫瘤早篩預測模型，腫瘤診斷的總體特異性為99.4%，敏感性為54.7%。

1.3.5 端粒酶逆轉錄酶(TERT) TERT基因啟動子區(qū)突變在大多數(shù)腫瘤中都存在。在膽囊癌中TERT啟動子突變頻率為9.1%；在肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, ECC)中出現(xiàn)的頻率為6.7%；在HCC中出現(xiàn)的頻率為0.5%～57.2%；TERT啟動子區(qū)變異在低級別和高級別肝臟增生性結節(jié)中經常出現(xiàn)，被認為是HCC發(fā)生的早期分子事件，可作為潛在的輔助臨床診斷標志物[12]。

1.3.6 微小RNA 微小RNA是由21～25個核苷酸構成的非編碼小分子RNA，具有組織特異性、腫瘤特異性、可由外泌體途徑分泌入血及穩(wěn)定性強等特點，已被發(fā)現(xiàn)在HCC診斷和協(xié)同診斷中具有重要作用。血漿中檢測到的微小RNA，包括微小RNA-122、192、21、223、26a、27a、801等，可鑒別診斷HCC,其受試者工作特征曲線下面積為0.84～0.94[13]。同時微小RNA-26a在HCC組織中低表達的患者，可以在肝癌切除術后的干擾素輔助治療中顯著獲益[14]。

1.4 專家推薦意見

(1)建議使用血清學AFP、AFP-L3以及DCP聯(lián)合檢測，結合患者影像學表現(xiàn)，作為臨床HCC篩查、診斷的標志物。

(2)建議結合組織形態(tài)學，病理組織檢測HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和AFP，作為HCC診斷的免疫標志物；聯(lián)合應用GPC-3、熱休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶作為早期HCC臨床病理診斷(3項免疫標志物中2項陽性)的免疫標志物；CK7、CK19和黏蛋白-1作為CCA臨床病理診斷的免疫標志物。

(3)建議使用血清學糖類抗原19-9、125及癌胚抗原聯(lián)合檢測，結合影像學特點作為CCA臨床診斷的標志物。

(4)建議使用血清學糖類抗原19-9檢測，結合影像學特點作為膽囊癌臨床診斷的標志物。

(5)ctDNA、微小RNA等血清學標志物，由于檢測成本較高，且缺乏大規(guī)模臨床試驗結果論證，缺乏組織和腫瘤特異性特征，建議可作為肝膽腫瘤患者診斷及篩查的參考指標。

(6)建議肝膽腫瘤根治性治療術后，參考使用上述血清學標志物結合影像學檢查進行動態(tài)監(jiān)測。

2 治療相關的標志物

2.1 靶向治療相關的分子標志物

2.1.1 血管內皮生長因子(VEGF)A VEGFA基因屬于PDGF/VEGF生長因子家族。它編碼一種肝素結合蛋白，并能誘導血管內皮細胞的增殖和遷移，是生理和病理狀態(tài)下血管生成所必需。該基因在許多腫瘤中表達上調，其表達與腫瘤分期及進展相關。基于熒光原位雜交結果估計，HCC患者中VEGFA擴增率為7%～11%，高VEGF血漿水平與較差的生存期相關[15]。一項回顧性臨床研究[16]提示，攜帶VEGFA基因擴增的晚期HCC患者，對索拉非尼治療有較好的反應性。

2.1.2 RAS基因 一項Ⅱ期臨床研究結果顯示，接受索拉非尼與MEK抑制劑Refametinib(BAY 86-9766)聯(lián)合治療不可切除的東亞HCC患者，4例(5%)血漿中出現(xiàn)KRAS突變的患者有3位確定為部分緩解(PR)，響應持續(xù)時間分別為128、335和382 d，提示攜帶RAS突變的HCC患者與RAS野生型患者相比，對索拉非尼與Refametinib聯(lián)合治療有更好的臨床反應性[17]。

2.1.3 MET基因 在多種惡性腫瘤中，MET基因的突變或者擴增，會持續(xù)激活c-MET信號，使細胞增殖失控并促進腫瘤轉移。MET突變在HCC中的發(fā)生頻率約為1.89%；在CCA中的突變頻率約為1.44%。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者的腫瘤組織中c-MET表達水平較高，并與索拉非尼的耐藥相關；高表達c-MET的HCC細胞中，卡博替尼能夠高效抑制MET活性，抑制血管生成、細胞增殖、細胞遷移和侵襲，促進細胞凋亡[18]。

2.1.4 TP53基因 TP53是惡性腫瘤中最常見的突變基因，在超過50%的腫瘤中檢測到該基因的突變，同時，其突變被認為與多種腫瘤患者的不良預后相關。晚期HCC患者腫瘤組織中可檢測到TP53(35%)和WNT/β-catenin信號通路突變(45%)，并且表現(xiàn)為相互獨立的分子亞型[19]。TP53在早期復發(fā)與無早期復發(fā)患者存在差異(P=0.057)。WNK2、RUNX1T1、CTNNB1、TSC1與HCC患者根治性切除術后早期腫瘤復發(fā)相關[20]。目前國內外尚無批準靶向TP53基因的抗腫瘤藥物，但WEE1抑制劑AZD1775在TP53突變的實體瘤患者中正在展開臨床試驗[21]。

2.1.5 纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)19FGF19基因編碼的蛋白是FGF家族成員，參與人體胚胎發(fā)育、細胞生長、形態(tài)發(fā)生、組織修復、腫瘤生長和侵襲等多種生物學過程。5%～14%的HCC中存在FGF19、CCND1(染色體11q13中的增加)異常，且其高表達水平和患者不良預后相關[22]。CCND1與FGF19共享基因組基因座，常在癌癥中擴增。2019年，美國臨床腫瘤學會會議報道，高選擇性的共價FGFR4抑制劑(H3B-6527)對于HCC治療耐受性良好，可使FGF19信號傳導發(fā)生變異的HCC-CCA患者獲益(NCT02834780)。

2.1.6 異檸檬酸脫氫酶1/2(IDH1/IDH2) IDH基因突變見于膠質瘤、急性髓細胞性白血病、肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)等多種癌癥。IDH1/IDH2突變在ICC中的出現(xiàn)頻率為10%～23%[23]，IDH1 R132位點的點突變較為常見。IDH基因突變與ICC患者預后顯著相關，發(fā)生IDH1/IDH2基因突變的患者3年存活率為33%，而IDH1/IDH2野生型的患者3年存活率為81%(P=0.003)[24]。2019歐洲腫瘤內科學會報道，IDH抑制劑Ivosidenib治療CCA的Ⅲ期臨床試驗結果顯示，與安慰劑相比，Ivosidenib顯著改善晚期IDH1突變的CCA患者的無進展生存期(PFS,P<0.001)，總生存期(OS)也有獲益。

2.1.7 PI3K/mTOR信號通路 PI3K/mTOR信號通路相關的基因有PIK3CA、PTEN、STK11、TSC1、TSC2、MTOR等，是肝膽腫瘤中最重要的信號通路之一。在HCC中，PIK3CA突變頻率約為4%，PTEN缺失突變頻率約為7%。文獻報道PIK3CA基因變異出現(xiàn)的頻率為4%～7.5%[25]。臨床研究提示，PI3K、Akt和mTOR抑制劑可以作為PIK3CA突變的腫瘤患者潛在的治療靶點(NCT00962611、NCT02449538等)。多種PI3K抑制劑，包括Buparlisib、Taselisib和Apitolisib等正在PIK3CA激活變異、PTEN突變的肝膽系統(tǒng)腫瘤中開展臨床試驗。依維莫司一線治療進展期膽道腫瘤的Ⅱ期臨床試驗結果顯示，其12周疾病控制率(DCR)為48%，治療耐受性良好。依維莫司作為一線單一療法在晚期膽道腫瘤中表現(xiàn)出了較好的臨床效果[26]。另外，有研究認為，PTEN缺失可能與PD-1/PD-L1抑制劑耐藥相關，但尚需進一步的臨床驗證[27]。

2.1.8 同源重組修復缺陷(homologous recombination deficiency, HRD) HR是DNA損傷修復的機制之一。當某個或多個同源重組修復基因發(fā)生變異時，可能導致HRD。HR通路涉及的基因包括BRCA1/2、PALB2、ATM、ATR、CHEK1/2、BARD1、BRIP1、MRE11A、RAD51基因家族和FANC基因家族等。根據(jù)2018年美國癌癥研究協(xié)會一項實體腫瘤HRD與腫瘤突變負荷(tumor mutation burden, TMB)相關性研究(No.1369)結果，HRD在HCC和CCA中的發(fā)生頻率分別為28.7%和20.8%，靶向抑制PARP已成為BRCA1/2或PALB2基因缺陷腫瘤的潛在治療策略。攜帶BRCA1/2突變的患者(7例ICC，1例HCC)，在多種治療失敗后用PARP抑制劑奧拉帕尼治療，3例患者部分緩解(PR)，2例患者病情穩(wěn)定(SD)達3～5個月[28]。

2.1.9 纖維母細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR) FGFR家族受體成員FGFR1-3編碼成纖維細胞生長因子受體1-3，F(xiàn)GF/FGFR激活突變、擴增或基因融合會導致FGFR持續(xù)激活，促進多種腫瘤進展。11%的ICC和3%的膽囊癌可檢測到FGFR1-3基因變異[29]。在11%～45%的CCA中檢測到FGFR2基因融合，常見形式主要有FGFR2-ZMYM4、FGFR2-BICC1融合等[30]。FDA已批準如厄達替尼、侖伐替尼、瑞戈非尼、普納替尼、培唑帕尼等多種FGFR的激酶抑制劑用于腫瘤的臨床治療。晚期/轉移性或手術無法切除CCA患者的二線治療臨床試驗(FIGHT-202)顯示，F(xiàn)GFR2基因易位的CCA患者Pemigatinib(INCB54828)臨床治療效果顯著，客觀緩解率(ORR)達40%，其中40%PR，45%SD；DCR為85%，中位無進展生存期(mPFS)為9.2個月，中位總生存期為15.8個月(NCT02924376)。另一FGFR抑制劑BGJ398在FGFR變異(48例FGFR2融合、8例突變和3例基因擴增)的晚期CCA患者中開展的Ⅱ期二線臨床試驗(NCT02150967)顯示，ORR為14.8%(在FGFR2融合患者中為18.8%)，DCR為75.4%(在FGFR2融合患者中為83.3%)，mPFS5.8個月[31]。普納替尼、瑞戈非尼在膽道腫瘤的臨床試驗也在進行中。

2.1.10 ERBB2基因 ERBB2(又名HER2/neu)基因，屬于人類表皮生長因子受體家族(human epithelial factor receptor, HER)。該家族包括4個成員：EGFR、HER2、HER3以及HER4，均編碼跨膜受體酪氨酸激酶，參與生長因子介導的致癌信號級聯(lián)放大傳遞。HER2基因突變在CCA中發(fā)生頻率約為3.9%，在膽囊癌中約為11.0%[32]。研究顯示，HER2在膽囊上皮中的持續(xù)表達能夠導致腺癌的發(fā)生。膽囊癌中，12.8%患者存在HER2蛋白過表達，而且過表達的患者5年OS相對較差?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，HER2基因擴增或過表達的膽囊癌患者(8例)使用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗和拉帕替尼治療，3例為SD，4例為PR，1例為CR[33]。1例HER2過表達的轉移性膽囊癌患者使用曲妥珠單抗治療后，其病情緩解持續(xù)時間為4個月[34]；1例攜帶HER2擴增的轉移性CCA患者經曲妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇治療后，臨床療效顯著[35]。

2.1.11 BRAF基因 BRAF為編碼RAF蛋白激酶的家族成員之一，主要參與MAP激酶級聯(lián)反應，該信號激活能夠促進細胞增殖、生存、遷移和分化。據(jù)報道，膽道腫瘤中BRAF突變頻率的差異很大：膽囊癌的變異頻率為0～33%，CCA的變異頻率為0～22%[36]。最常見的BRAF基因變異是V600E突變，位于BRAF基因激酶激活域。V600E突變的BRAF激酶活性大約是非突變型的500倍，可持續(xù)激活下游MEK/ERK信號通路。FDA批準達拉非尼、維莫非尼和Encorafenib，以及MEK抑制劑曲美替尼、卡博替尼和Binimetinib等BRAF抑制劑單藥或聯(lián)合治療多種攜帶BRAF V600位點突變的腫瘤。BRAF V600E突變還與BRAF抑制劑(維莫非尼、達拉非尼等)敏感性增強有關[37]。達拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療BRAF V600E突變的CCA患者，ORR達41%，且安全可耐受(NCT02034110)。

2.2 免疫治療相關的分子標志物

2.2.1 程序性細胞死亡配體-1(programmed cell death ligand, PD-L1) PD-L1常見于表達在腫瘤細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面，具有誘導免疫逃逸的功能；體內也存在細胞外的游離型PD-L1，分為可溶性PD-L1分子(sPD-L1)和外泌體型PD-L1。sPD-L1被證實與多種腫瘤患者預后不良相關。血清外泌體型PD-L1升高能激活腫瘤的免疫逃逸，導致PD-1/PD-L1單抗療效不佳[38]。大量臨床試驗表明，組織中PD-L1表達陽性是免疫檢查點抑制劑療效評估和患者預后的重要分子標志物，但對于PD-L1檢測陽性標準，不同癌種的不同抗體有不同的判斷標準。目前，研究數(shù)據(jù)表明對該結果存在爭議，而肝膽腫瘤中尚未見明確結論。

2.2.2 TMB TMB是指腫瘤基因組中平均1Mb范圍內所包含的體細胞蛋白編碼區(qū)點突變、插入缺失等基因變異數(shù)量。高TMB與多種因素相關，如DNA聚合酶POLE和POLD1的DNA“校對”結構域的突變、錯配修復缺陷(mismatch repair deficient, dMMR)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)等。高TMB與免疫檢查點抑制劑治療腫瘤較好的臨床響應相關[39]，這種獲益可能與高TMB患者腫瘤細胞新抗原增加有關。晚期HCC患者TMB中位值約為4個突變/Mb，95%的患者TMB<10個突變/Mb，6.89%樣本TMB≥10個突變/Mb。PD-1抑制劑治療HCC的研究報道1例(5.8%)患者(TMB=15個突變/Mb，MSI低)對納武利尤單抗保持完全應答狀態(tài)持續(xù)超過2年[40]。另有個案報道也顯示免疫聯(lián)合治療對PD-L1(+)/TMB-H的ICC患者療效明顯[41]。

2.2.3 MSI及堿基錯配修復(mismatch repair, MMR) MMR相關基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)的功能失活可導致MSI-H，表現(xiàn)為堿基插入或缺失產生的基因組中簡單重復序列(微衛(wèi)星)長度的改變。一項晚期HCC基因組測序研究報道，僅發(fā)現(xiàn)0.2%的患者MSI-H。NCCN指南中推薦，對于不可切除和轉移性CCA患者，推薦增加分子檢測，包括MMR檢測，并推薦帕博利珠單抗用于MSI-H/dMMR的ICC、ECC和膽囊癌患者[42]。

2.2.4 特定的基因變異 特定基因的突變可能影響腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的能力。在不同腫瘤中免疫相關的特定的基因變異，如STK11/LKB1、POLE的激活突變、B2M的雜合性缺失等，可預測免疫治療應答率。Wnt/CTNNB1突變是HCC免疫排斥亞型的特征[43]，具有Wnt-β-catenin通路突變的HCC患者對免疫檢查點抑制治療耐藥，其中位生存期較差(突變患者為9.1個月，未突變患者15.2個月)。

2.3 專家推薦意見

(1)整體來說，對于肝膽腫瘤，無論靶向治療(索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼等)還是免疫治療(PD-1單抗、PD-L1單抗、CTLA-4單抗等)，均無明確的標志物能夠預測患者療效和預后。臨床實踐中，不推薦在靶向治療或/和免疫治療前常規(guī)行基因篩查檢測。

(2)HCC靶向治療(索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼等)前，不推薦常規(guī)進行基因篩查預測療效，但可結合臨床實際情況或臨床試驗，對患者進行RAS、MET、HRD、VEGFA等基因檢測，為HCC耐藥后治療以及聯(lián)合治療提供參考依據(jù)。

(3)臨床中可結合實際情況或臨床試驗，嘗試對CCA/膽囊癌患者進行FGFR、ERBB2、BRAF、IDH、HRD、PI3K/mTOR、FGF19等基因檢測，探索患者個體化靶向治療的新方案。

(4)肝膽腫瘤免疫治療前(PD-1單抗、PD-L1單抗、CTLA-4單抗)不建議通過常規(guī)基因篩查選擇免疫治療優(yōu)選人群。但可結合臨床實際情況或者臨床試驗，對患者進行組織學或血清學PD-L1、TMB、MSI等檢測，探索免疫治療有效的分子診斷標志物。

(5)所有標志物的檢測，僅為肝膽腫瘤靶向和/或免疫治療提供臨床參考。由于肝膽腫瘤基因異質性、個體差異性、免疫微環(huán)境等多種影響因素存在，即使是由具有分子生物學背景、臨床經驗豐富的資深醫(yī)師指導治療，亦無法保證所有患者的臨床獲益。迫切需要開展多中心、大規(guī)模臨床試驗，以明確肝膽腫瘤靶向和/或免疫治療過程中的有效分子標志物。

3 腫瘤標志物的檢測質控

3.1 血清腫瘤標志物 國家衛(wèi)生行業(yè)標準《常用血清腫瘤標志物檢測的臨床應用和質量管理》規(guī)范了各種標志物的應用以及質控、報告的注意事項等各個方面，應注意患者進行血液樣本采集時的生理變化、疾病情況、不良嗜好以及用藥情況等。血液樣本應避免溶血、樣本污染。采集后應及時處理，根據(jù)需要選擇儲存條件，避免反復凍融。腫瘤標志物檢測的方法很多，腫瘤標志物的連續(xù)檢測、判斷療效或復發(fā)監(jiān)測時應使用同一檢測系統(tǒng)進行，以保證測定結果的可比性。實驗室要求詳見：臨床實驗室室間質量評價要求(GB/T20470)、室間質量評價結果應用指南(WS/T414)、臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能驗證(WS/T420)及臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證(WS/T492)等。

3.2 病理免疫組化

(1)病理申請單上應包含患者的基本信息、采集標本的部位、方法(穿刺、活檢、手術等)，盡可能將腫瘤標本在離體30 min以內完整送達病理科進行切開固定。

(2)注意使用試劑的保存(避免反復凍融、污染等)，建立組織處理、免疫組化切片、抗原修復、染色操作等的標準化流程。

(3)嚴格按照相關分級標準進行結果判定，最大限度規(guī)避因主觀因素造成的結果差異[44]。

(4)病理報告建議除常規(guī)病理結果、免疫組化結果、典型圖片外，建議包含與肝臟惡性腫瘤潛在藥物靶點檢測、生物學行為評估以及預后判斷等相關的分子病理學結果。

3.3 二代測序(next generation sequencing, NGS)實驗過程及檢測報告的要求

3.3.1 實驗過程的要求

(1)NGS需建立并遵循流程質量管理體系文件，便于查詢及追溯。

(2)NGS實驗室需制定防污染措施及控制。實驗室操作應符合《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)[45]，進行定期通風及紫外照射處理。實驗操作過程中，要嚴格執(zhí)行各區(qū)功能劃分、擦拭實驗用品等避免交叉污染。

(3)NGS分析過程樣本質量要求[46]。A接收樣本類型可選用福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊、石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。B樣本接收后需由病理專業(yè)人員對其進行檢查，以進一步明確樣本取樣來源及腫瘤含量占比。C核酸提?。盒枋褂媒涍^驗收合格的試劑對檢測類型進行抽提。實驗耗材應一次性使用，避免污染。抽提好的DNA需經過凝膠電泳、定量等鑒定其結果是否滿足后續(xù)測序。D構建文庫：將提取合格的DNA進行文庫構建，對其進行目的基因的抓取，得到的文庫進行質檢查看其峰形及總量的占比。E測序上機：添加質控樣品作為參照，選取合適的測序平臺及芯片對樣本進行測序。

3.3.2 檢測報告的要求

(1)陽性變異判讀。明確陽性變異位點，包括點突變、插入缺失、拷貝數(shù)變化及結構變異等。尤其是對于串聯(lián)重復序列的插入缺失突變；構建自己實驗室內部的假陽性數(shù)據(jù)庫，有效剔除假陽性；規(guī)范命名，命名建議遵循人類基因組變異學會命名規(guī)則。

(2)變異分類。篩選臨床相關變異：A明確變異分類的標準，包括已知報道變異、新發(fā)變異等。B依照臨床證據(jù)對變異的腫瘤相關性(治療、診斷、預后)分析，證據(jù)等級評定。

(3)對臨床意義明確變異進行詳細解釋。A結合證據(jù)等級進行用藥推薦(國內外相應規(guī)范，專家共識等)，變異功能注釋做到客觀、準確、嚴謹。B報告的基本內容板塊可以參考《臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識》中的結果解釋及報告[46]。C.復核是否有文字錯誤。

(4)其他。對于動態(tài)監(jiān)測的患者，需結合既往NGS檢測結果比較分析。

4 小結

結合HCC患者基因表達、突變水平，推薦將HCC分為增殖型和非增殖型。增殖型HCC一般具有HBV感染的背景，且AFP很高，腫瘤進展更快、惡性程度更高，患者預后更差。非增殖型HCC一般是由于HCV感染或酒精性肝病所致，患者預后相對較好[47]。另一方面，聯(lián)合患者體內TMB與T細胞炎癥基因(PD-L1、CTLA-4等)水平，可將肝膽腫瘤免疫微環(huán)境分為4型，其中以高TMB、高炎癥細胞浸潤為特征的1型微環(huán)境腫瘤，對于免疫治療效果最佳，而以低TMB、缺乏炎癥細胞浸潤——“免疫荒漠”為特征的2型微環(huán)境腫瘤，對于免疫治療療效最差[48]。此外，肝膽腫瘤免疫治療中，我們還應關注腫瘤免疫治療中超進展的情況(hyperprogressive disease, HPD)。數(shù)據(jù)顯示，腫瘤免疫治療中HPD發(fā)生率在10%左右[49-50]，MDM2、MDM4、EGFR及11q13區(qū)間(包含CCND1、FGF19、FGF3、FGF4)基因擴增可能與腫瘤免疫治療HPD相關[51]，肝膽腫瘤免疫治療HPD發(fā)生率、預測標志物等還需要進一步研究觀察。

本共識編撰指導專家(按姓氏拼音排名)：蔡建強(中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院)，盧實春(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心)，秦叔逵(解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)，趙景民(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，張寧(北京大學)，Xinwei Wang(美國國立衛(wèi)生研究院/國家腫瘤研究所)，Lewis Roberts(梅奧診所)

參與共識討論的專家(按姓氏拼音排名)：安文林(北京化工大學)，白凡(北京大學)，畢新宇(中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院)，常東(復旦大學附屬浦東醫(yī)院)，陳剛(山西太原市第三人民醫(yī)院)，成軍(首都醫(yī)科大學附屬地壇醫(yī)院)，崔久嵬(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心)，陳敏山(廣州中山大學腫瘤防治中心)，陳志翱(復旦大學腫瘤研究所)，杜映榮(云南省昆明市第三人民醫(yī)院)，古槿(清華大學自動化系)，洪智賢(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，莢衛(wèi)東(中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院)，賈曉東(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，匡銘(廣州中山大學附屬第一醫(yī)院)，李海洋(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)，劉連新(中國科技大學附屬醫(yī)院)，魯志(清華大學生科院)，羅莉(貴州省貴航貴陽醫(yī)院)，郎韌(北京朝陽醫(yī)院)，劉秀峰(解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)，梁躍東(貴州省貴陽市公共衛(wèi)生救治中心)，劉振文(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，潘杰(北京協(xié)和醫(yī)院)，浦立勇(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)，彭濤(廣西醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)，錢紅綱(北京大學腫瘤醫(yī)院)，孫斌(首都醫(yī)科大學附屬佑安醫(yī)院)，宋天強(天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院)，蘇昕(北京化工大學)，譚曉東(中國醫(yī)大盛京醫(yī)院)，王華(安徽醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)，王魯(復旦大學腫瘤醫(yī)院)，王立明(大連醫(yī)科大學附屬二院)，王楠婭(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心)，王瓊(江陰市人民醫(yī)院腫瘤科)，吳向未(新疆石河子大學醫(yī)學院)，汪小我(清華大學自動化系)，夏鋒(陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院)，薛瑞棟(北大醫(yī)院)，楊松(首都醫(yī)科大學附屬地壇醫(yī)院)，尹洪芳(北京清華長庚醫(yī)院)，虞朝輝(浙江醫(yī)科大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院)，云徑平(廣州中山大學腫瘤防治中心)，周光德(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，張佳林(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)，趙明(廣州中山大學腫瘤醫(yī)院)，張寧(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，趙攀(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，張強(淄博市第四人民醫(yī)院腫瘤科),左石(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)，趙雪珂(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)，智緒亭(山東大學齊魯醫(yī)院),曾義嵐(四川省成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心)，趙一鳴(復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院)，曾珍(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，朱震宇(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)

執(zhí)筆專家：陸蔭英(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，趙海濤(北京協(xié)和醫(yī)院)，程家敏(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心)，姬峻芳(浙江大學生命科學院)