徐 鋒 沈莉萍 張維誼 齊新永 陸仲斐 朱培元 王 建*

（1上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海市長(zhǎng)寧區(qū) 201103；2上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海市青浦區(qū) 201708）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的一大難題，直接影響著牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，偶爾也會(huì)引起乳品安全問(wèn)題[1]，而在近幾年國(guó)內(nèi)報(bào)道的奶牛乳房炎的病原菌中，大腸桿菌占比已超過(guò)金黃色葡萄球菌、穩(wěn)居首位[2-4]，且在生鮮乳中，大腸桿菌也有較高的檢出率[5-7]，有的甚至高達(dá)50.83%[8]。

上海地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原菌一直是以金黃色葡萄球菌為主的革蘭氏陽(yáng)性球菌[9-10]，但近幾年的相關(guān)報(bào)道較少。同時(shí)，由于《GB 19301-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生乳》的頒布，取消了對(duì)生鮮乳中致病菌的檢測(cè)，更導(dǎo)致相關(guān)數(shù)據(jù)缺乏。因此，上海地區(qū)奶牛乳房炎主要致病菌的變化，是否會(huì)導(dǎo)致生鮮乳中致病菌的變化，是否會(huì)對(duì)上海地區(qū)乳品安全造成威脅，還需進(jìn)行深入探討和研究。在此背景下，筆者擬對(duì)上海地區(qū)幾家乳品加工廠生產(chǎn)的生鮮乳中的大腸桿菌進(jìn)行摸底調(diào)查，以期了解其污染程度、致病性、耐藥性及血清型分布情況，從而評(píng)估生鮮乳中的大腸桿菌對(duì)食品安全是否存在風(fēng)險(xiǎn)，并擬通過(guò)對(duì)環(huán)境樣本中大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，查找可能的污染源，以便采取相應(yīng)的措施，避免或減少生鮮乳中大腸桿菌的污染?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 本

生鮮乳樣本：分別于2019年9月和12月分2次進(jìn)行樣本采集，共80份樣本，采集自上海的3個(gè)乳品加工廠，樣本來(lái)源于40個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。

環(huán)境樣本：2019年9月—12月分4次采樣，共163份樣本，包括乳頭奶、乳房表面拭子、操作人員手部拭子、奶罐奶、奶襯表面拭子、墊料、飼料、土壤、糞便等，均采自同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化奶牛場(chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）、Columbia血瓊脂基礎(chǔ)等培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋。

1.1.3 試 劑

產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）細(xì)菌的核酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海之江；大腸桿菌腸道產(chǎn)毒性（ETEC）、腸道侵襲性(EIEC)、腸道致病性（EPEC）分型血清購(gòu)自蘭州生物制品研究所；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。

1.1.4 主要儀器

儀器主要是微生物質(zhì)譜鑒定儀（VITEK MS，法國(guó)生物梅里埃）、熒光PCR儀（7500，ABI）、普通PCR儀（Biometra TAdvanced，德國(guó)耶拿）。

1.2 排查方法

1.2.1 樣本處理

生鮮乳、乳頭奶等液體樣本和拭子樣本直接取樣；墊料、飼料、土壤和糞便樣本稱取5 g加入到含50 mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌過(guò)濾袋中，充分混勻，然后取濾液作為檢測(cè)樣本。

1.2.2 生鮮乳中菌落總數(shù)的測(cè)定

吸取25 mL樣品至盛有225 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分混勻，制成10-1樣品勻液；取1 mL 10-1樣品勻液至9 mL滅菌生理鹽水無(wú)菌試管中進(jìn)行10倍稀釋，依次10倍稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5；吸取1 mL各稀釋度的樣品勻液，置于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿重復(fù)，同時(shí)做空白對(duì)照；將冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注至平皿中，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻；待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，于36 ℃±1 ℃下培養(yǎng)48 h±2 h。

表1 PCR引物序列

1.2.3 大腸桿菌的分離鑒定

鑒定：取1 mL檢樣加入到9 mL EC肉湯培養(yǎng)基中，振蕩混勻后于36 ℃培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)蘸取增菌液分別接種EMB平板和MAC平板，于36℃下培養(yǎng)24 h；然后從EMB平板和MAC平板分別挑取若干可疑菌落，接種Columbia羊血平板進(jìn)行純化，于36 ℃下培養(yǎng)18～24 h；再用1 μL接種環(huán)挑取單菌落均勻涂在靶板位點(diǎn)上，然后滴加1μL MS-CHCA基質(zhì)液覆蓋在上面，待完全干燥后，放入VITEK MS質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，約10 min后獲得鑒定結(jié)果。

血清分型：使用大腸桿菌腸道產(chǎn)毒性（ETEC）、腸道侵襲性(EIEC)、腸道致病性（EPEC）血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。

1.2.4 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)

對(duì)從生鮮乳中分離的大腸桿菌，選擇常見(jiàn)的8種毒力基因（K88、K99、987P、F18、F41、STa、STb、LT）進(jìn)行PCR檢測(cè)。

反應(yīng)體系（25 μL）：Taq 酶 preMix 12.5 μL，引物（濃度10 μM）各1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

核酸擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、退火溫度60 s、72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃-∞。

電泳采取1.5%濃度瓊脂糖凝膠。

2 結(jié)果與分析

2.1 生鮮乳中的菌落總數(shù)

由圖1可知，在80份生鮮乳樣本中，菌落總數(shù)最大值為2 900 CFU/mL，平均值為58.08 CFU/mL。

2.2 大腸桿菌的分離鑒定

通過(guò)對(duì)從80份生鮮乳樣本和163份環(huán)境樣本中分離的細(xì)菌進(jìn)行VITEK MS鑒定發(fā)現(xiàn)，生鮮乳中大腸桿菌的分離率為63.5%，而環(huán)境樣本中的大腸桿菌主要分離自墊料、土壤、糞便，分離率分別為75%、75%、50%。同時(shí)，鑒定還發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌和其它腸桿菌科細(xì)菌也有較高的占比。見(jiàn)圖2。

2.3 致病性大腸桿菌的血清分型

由表2可知，從生鮮乳中分離的50株大腸桿菌中，有15株致病性大腸桿菌，其中，腸道產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）菌株6株、占比為12%，腸道致病性大腸桿菌（EPEC）菌株9株、占比為18%；腸道侵襲性大腸桿菌(EIEC)菌株未檢出。

2.4 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)

由圖3可知，從生鮮乳中分離的50株大腸桿菌中，檢出5株攜帶K99基因（攜帶率為10%）、12株攜帶LT型基因（攜帶率為24%）、2株攜帶ST基因（包括STa和STb，攜帶率合計(jì)為4%）。

表2 致病性大腸桿菌血清分型

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，上海地區(qū)生鮮乳中的菌落總數(shù)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，符合國(guó)家規(guī)定；生鮮乳中大腸桿菌的檢出率較高，且有致病性大腸桿菌及其腸毒素的存在，故不宜直接食用；致病性大腸桿菌在巴氏滅菌乳中可能有殘留，在冷藏條件下可增殖，對(duì)乳品安全存在風(fēng)險(xiǎn)，建議對(duì)生鮮乳中致病性大腸桿菌進(jìn)行監(jiān)控，以杜絕隱患。

3.2 討 論

生鮮乳普遍采用巴氏消毒法進(jìn)行滅菌，通常采用65 ℃維持30 min或75～90 ℃維持15 s，但最近有報(bào)道表明，大腸桿菌O157:H7在80 ℃維持10 min，仍不能被完全殺滅[11]，說(shuō)明巴氏消毒奶細(xì)菌總數(shù)的達(dá)標(biāo)，不等于殺滅了所有的致病性大腸桿菌，且其在8 ℃左右仍可繁殖[12]，一旦冷鏈出現(xiàn)問(wèn)題或超過(guò)保質(zhì)期，就會(huì)影響奶質(zhì)，甚至?xí)斐墒澄镏卸尽Ｍ瑫r(shí)，在近幾年的奶牛乳房炎病原菌檢測(cè)中，大腸桿菌的占比居高不下。上海市及其周邊地區(qū)奶牛場(chǎng)的乳房炎奶牛乳中大腸桿菌的檢出率通常在20%～40%[3，13-14]。而本研究結(jié)果表明，上海地區(qū)生鮮乳中的菌落總數(shù)均未超標(biāo)，但大腸桿菌的分離率高達(dá)63.5%，這可能與上海地區(qū)潮濕的氣候有關(guān)，且大腸桿菌耐熱并能在低溫增殖的特點(diǎn)也是一個(gè)重要因素。

大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的常在菌，其分布極為廣泛，生活中幾乎無(wú)處不在，通常認(rèn)為是一種條件致病菌。本研究結(jié)果表明，環(huán)境樣本中墊料、土壤、糞便中的大腸桿菌分離率較高，證實(shí)了奶牛場(chǎng)環(huán)境中確實(shí)存在大量的大腸桿菌，而奶牛場(chǎng)是開(kāi)放式環(huán)境，空氣流動(dòng)、人員走動(dòng)、野生動(dòng)物走動(dòng)、運(yùn)輸工具流動(dòng)等都有可能造成污染，故要及時(shí)清除污染物，且采用科學(xué)的消毒方法就顯得尤為重要[15]。同時(shí)，在乳頭奶、乳房表面及操作人員手部等環(huán)境樣本中也分離到大腸桿菌，預(yù)示在整個(gè)擠奶過(guò)程中可能存在消毒不到位的問(wèn)題，需要對(duì)消毒劑的選擇、稀釋濃度、作用時(shí)間和人員的防范意識(shí)等進(jìn)行優(yōu)化。此外，在奶牛場(chǎng)的奶罐奶中未檢出有大腸桿菌，這與生鮮乳中的菌落總數(shù)結(jié)果（平均58.08 CFU/mL）相符，說(shuō)明上海地區(qū)生鮮乳的細(xì)菌污染程度較低，上海地區(qū)的奶源質(zhì)量是有保障的。

ETEC是引起人和動(dòng)物腹瀉的重要病原菌，其特征性的致病因子為腸毒素和黏附素。本研究中ETEC的檢出率為12%，而腸毒素基因的檢測(cè)率合計(jì)為28%（熱敏腸毒素LT基因?yàn)?4%，耐熱腸毒素ST基因?yàn)?%），表明有一半的菌株未鑒定出血清型，而這些菌株均有可能具有致病性。同時(shí)，鑒于LT腸毒素在60 ℃維持15 min才可被滅活，ST腸毒素在100 ℃維持15 min還能保持活性[16]，而本研究的腸毒素檢測(cè)結(jié)果以LT基因?yàn)橹?，ST基因只有個(gè)別菌株攜帶，表明上海地區(qū)的生鮮乳經(jīng)巴氏消毒后，大部分大腸桿菌腸毒素可被滅活而失去致病性，殘存的少量ST腸毒素被大量牛奶稀釋后對(duì)人類健康已不構(gòu)成威脅，但仍存在隱患，需要在源頭進(jìn)行根除。此外，ETEC和EPEC是引起犢牛腹瀉和敗血癥的主要病原菌，而規(guī)?；膛?chǎng)以K99菌毛致病菌株的致病率最高[17]，本研究?jī)H檢出K99基因，該結(jié)果與姜宣鵬等報(bào)道的奶牛場(chǎng)黏附素基因的檢測(cè)結(jié)果一致[18]，說(shuō)明本研究分離的部分大腸桿菌菌株來(lái)源于奶牛，且具有較強(qiáng)的致病性。

EPEC大多會(huì)引起幼畜和嬰幼兒腹瀉[19]，嚴(yán)重的甚至可以致死[20]。近幾年，在我國(guó)有關(guān)EPEC的感染發(fā)病已鮮有報(bào)道。本研究中EPEC的檢出率為18%，涉及O26、O44、O55、O114、O125五個(gè)血清群，這些血清型在國(guó)內(nèi)的牛源大腸桿菌中也均有檢出[21-22]，但由于EPEC同EHEC在遺傳和表型上很近，尤其是O26血清群和O55血清群的一些血清型歸屬于EHEC，其有很強(qiáng)的致病性，且本研究未檢測(cè)出志賀毒素及相關(guān)毒力基因，故目前無(wú)法進(jìn)行區(qū)分，需要進(jìn)一步開(kāi)展更加細(xì)致深入的研究。