雒林通 馬芳 唐德富

摘要 為挖掘益生菌調(diào)節(jié)下太平雞回腸SNP位點(diǎn)，將120只太平雞隨機(jī)分為對(duì)照組與益生菌組，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)太平雞回腸轉(zhuǎn)錄組的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：SNP類型中，轉(zhuǎn)換類型明顯高于顛換類型，對(duì)照組中轉(zhuǎn)換類型占22.55%～27.45%，顛換類型占11.43%～13.87%;益生菌組與對(duì)照組結(jié)果相似，轉(zhuǎn)換類型（22.53%～27.46%）明顯高于顛換類型（11.37%～13.94%）。SNP位置分析表明，對(duì)照組和益生菌組總SNP位點(diǎn)分別為4 684 072和4 647 171個(gè)，其中位于內(nèi)含子和基因間區(qū)的SNP位點(diǎn)最多。另外，在SNP功能分析中，同義突變SNP占比最高，在對(duì)照組和益生菌組中分別占7.01%和7.10%;非同義突變SNP在對(duì)照組和益生菌組中占比分別為2.97%和2.98%。該研究結(jié)果可為今后太平雞的分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建以及輔助育種等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 太平雞;益生菌;回腸;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;SNP

中圖分類號(hào) S831 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）21-0086-05

Abstract In order to excavate SNP sites in ileum of Taiping Chicken regulated by probiotics，120 Taiping chickens were randomly divided into control group and probiotic group.The SNP sites in the transcriptome of Taiping chickens ileum were analyzed by high throughput sequencing technique.The results showed that the transition proportion was significantly higher than that of the transversion.The transition of control group accounted for 22.55%-27.45%，and the transversion accounted for 11.43%-13.87%.The results of probiotic group were similar to those of control group，and the transition proportion （22.53%-27.46%） was significantly higher than that of the transversion （11.37%-13.94%）.The analysis of SNP locations showed that the total number of SNP sites in the control group and the probiotic group was 4 684 072 and 4 647 171 respectively，among which the most SNP sites were located in introns and intergenic.In the analysis of SNP function，the proportion of synonymous mutations of SNP was the highest，which was 7.01% in the control group and 7.10% in the probiotic group.Nonsynonymous mutations of SNP accounted for 2.97% in the control group and 2.98% in the probiotic group.This study could provide basic data for the development of molecular markers，the construction of genetic linkage map and the assistant breeding of Taiping Chicken in the future.

Key words Taiping Chicken;Probiotics;Ileum;Transcriptome sequencing;SNP

基金項(xiàng)目 甘肅省民生科技計(jì)劃項(xiàng)目（1503FCME005）;天水市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2020-SHFZKJK-7879）。

作者簡(jiǎn)介 雒林通（1973—），男，甘肅天水人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖方面的研究。*通信作者，副教授，博士，從事動(dòng)物遺傳育種方面的研究。

收稿日期 2020-06-02;修回日期 2020-06-23

太平雞具有較強(qiáng)適應(yīng)性和豐富的基因庫(kù)，是我國(guó)優(yōu)良家禽品種和甘肅三大優(yōu)良地方雞種之一，主要分布于甘肅康縣太平鄉(xiāng)（現(xiàn)為陽(yáng)壩鎮(zhèn)）因而得名[1]。太平雞以黑羽紅冠為主要特征，體格高大，體型緊湊，生產(chǎn)性能以肉用為主，肉蛋兼用，具有肉嫩骨細(xì)、皮脆味鮮、肉質(zhì)特佳等特點(diǎn)，在市場(chǎng)上具有較高的價(jià)值[2]。近年來(lái)，由于應(yīng)對(duì)雞群混養(yǎng)而導(dǎo)致太平雞雞種退化[3]、免疫性能低下等問(wèn)題，部分飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖戶為了追求養(yǎng)雞業(yè)效益的最大化以及疾病防治中用藥的誤區(qū)，往往存在大劑量使用抗生素[3]，使得藥物殘留、耐藥菌株大量出現(xiàn)、損傷消化免疫系統(tǒng)等問(wèn)題頻發(fā)[4]，對(duì)人與自然的可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅，成為食品安全和綠色可循環(huán)畜牧業(yè)發(fā)展中最突出、最嚴(yán)峻的問(wèn)題[5]，所以積極尋找綠色飼料添加劑，對(duì)太平雞進(jìn)行遺傳改良、選育新品種已成為提高養(yǎng)殖效益和健康化養(yǎng)殖水平的當(dāng)務(wù)之急。

益生菌（probiotic）指的是在人和動(dòng)物腸道內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物區(qū)系平衡對(duì)宿主健康有益的活性微生物菌種[6]。研究表明，益生菌可以維持動(dòng)物機(jī)體腸道菌群平衡，抵抗病原菌入侵，分泌抗菌物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)和改善腸道黏膜免疫功能[7-8]。益生菌進(jìn)入機(jī)體腸道后，刺激宿主腸道分泌多種消化酶，通過(guò)充分降解宿主體內(nèi)未被消化吸收的抗?fàn)I養(yǎng)因子而提高飼料利用率，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能的提高具有促進(jìn)作用。益生菌在宿主腸道內(nèi)借助體內(nèi)發(fā)酵作用產(chǎn)生的有機(jī)酸（乙酸、乳酸和丙酸）來(lái)有效降低腸道pH，這不利于有害菌的生長(zhǎng)，且益生菌分泌并誘導(dǎo)產(chǎn)生抑菌蛋白對(duì)致病菌生長(zhǎng)具有抑制作用[9]。此外，益生菌通過(guò)刺激宿主腸道分泌免疫抗菌物質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)[10]。因此，益生菌制劑作為一種新型的微生物飼料添加劑，在其調(diào)節(jié)下能更好地促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康和穩(wěn)定發(fā)展。

作為第三代分子標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是由單個(gè)核苷酸的變異而導(dǎo)致基因組層面DNA序列的多態(tài)性，通常表現(xiàn)為單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換、缺失或插入，但實(shí)際上發(fā)生的只有轉(zhuǎn)換和顛換2種[11]。由于覆蓋密度大，具有遺傳穩(wěn)定性和代表性，便于高通量自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析、分子輔助育種、群體遺傳系統(tǒng)、品種鑒定等方面，并表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[12-14]。筆者以太平雞為研究對(duì)象，通過(guò)在飲水中添加益生菌制劑，通過(guò)高通量測(cè)序分析其對(duì)太平雞回腸多態(tài)性位點(diǎn)的干預(yù)作用，利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇從而獲得更大的遺傳進(jìn)展，以期為太平雞的遺傳與育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用益生菌制劑由安徽諾偉康飼料有限公司生產(chǎn);試驗(yàn)動(dòng)物為60日齡太平雞，由隴南市康縣梅園太平山雞養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料 選擇0日齡太平雞120只，隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。對(duì)照組（CT）飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組（MP）在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上每升飲水中加入2 mL益生菌。飼料采購(gòu)嚴(yán)格按照GB13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和NY 5032—2006《無(wú)公害食品畜禽飼料和飼料添加劑使用準(zhǔn)則》執(zhí)行。參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33—2004）配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1～2。

1.3 飼養(yǎng)管理及樣品采集

第1～3天，溫度保持在33～35 ℃，此后每7 d降低2 ℃，直到最終室溫在18～21 ℃。光照時(shí)間1～3日齡為23～24 h，4～15日齡為23～16 h，16～60日齡為16～12 h;1～3日齡光照強(qiáng)度為10～30 lx，4～15日齡為5 lx，16～60日齡逐漸接近自然光照。室內(nèi)相對(duì)濕度55%～70%，自由采食和飲水。

試驗(yàn)用太平雞飼養(yǎng)至60日齡，各組每個(gè)重復(fù)取1只雞，即每組共3只雞。對(duì)照組（CT）樣品編號(hào)分別為CT1、CT2、CT3，試驗(yàn)組（MP）樣品編號(hào)分別為MP1、MP2、MP3。稱重后心臟注射空氣致死，用新潔爾滅進(jìn)行雞體消毒后，拔掉腹部羽毛，開腹后分離回腸，液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存。

1.4 RNA提取

用TRIzol試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分別提取MP1、MP2、MP3和CT1、CT2、CT3 6組回腸樣品的總RNA。RNA的降解和污染程度用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RNA純度使用Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)，RNA濃度和完整性用Qubit 2.0 Flurometer（Life Technologies，CA，USA）和Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（AgilentTechnologies，CA，USA）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組CDNA文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)檢 試驗(yàn)流程按照樣品制備試劑盒操作說(shuō)明的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行。每個(gè)樣品取3 μL的RNA用作RNA樣品準(zhǔn)備的輸入材料構(gòu)建6個(gè)測(cè)序文庫(kù)。流程如下：通過(guò)帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，用超聲波將mRNA打斷。以片段化的mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase Ⅰ 體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)。建庫(kù)原理如圖1所示。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

文庫(kù)質(zhì)檢合格后用Illumina HiseqTM2500平臺(tái)進(jìn)行pairedend測(cè)序，測(cè)序完成后將得到的序列進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量閱讀框和去污染處理，得到干凈序列。對(duì)得到的序列進(jìn)行GC含量和Q30分析，以保證測(cè)序質(zhì)量。

1.7 SNP挖掘及統(tǒng)計(jì)分析

為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，首先通過(guò)去除含adapter的reads，含N比例大于10%的reads，含N比例大于10%的reads，全部都是A堿基reads和低質(zhì)量reads （質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read的50%以上），對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾。然后利用GATK2軟件包進(jìn)行SNP檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取和質(zhì)量檢測(cè)

該研究提取的RNA如圖2所示，RNA樣品28S、18S、5S條帶清晰無(wú)降解;紫外分光光度法和Nanodrop結(jié)果表明OD260 nm/OD280 nm為1.8～2.0，RNA的完整性和純度都較好，達(dá)到Illumina的測(cè)序要求（表3），可用于后續(xù)的基于 HiseqTM2500平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

樣品測(cè)序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估情況見(jiàn)表4。對(duì)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行錯(cuò)誤率檢查，結(jié)果表明在測(cè)序長(zhǎng)度范圍內(nèi)，6個(gè)文庫(kù)中堿基的錯(cuò)誤率均低于0.1%;對(duì)GC含量分布進(jìn)行檢測(cè)，GC含量比例也在正常范圍內(nèi);用Fast QC分析軟件對(duì)Reads文件進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，每堿基質(zhì)量的Q20值和Q30值最低為92.47%，表明此次測(cè)序質(zhì)量較高，滿足后續(xù)分析的要求。測(cè)序所得的原始序列經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)后，過(guò)濾剔除帶接頭的、低質(zhì)量的reads，6個(gè)文庫(kù)分別得到了7.3～8.7 G的clean reads，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。

2.3 SNP位點(diǎn)分析

2.3.1 SNP顛換、轉(zhuǎn)換信息。

對(duì)太平雞SNP類型的分析（表5）發(fā)現(xiàn)，CT組中轉(zhuǎn)換類型占22.55%～27.45%，顛換類型占11.43%～13.87%。轉(zhuǎn)換類型明顯高于顛換類型，MP組與CT組結(jié)果相似，轉(zhuǎn)換類型（22.53%～27.46%）明顯高于顛換類型（11.37%～13.94%）。轉(zhuǎn)換類型中，2組中G→A發(fā)生頻率最高，分別為27.46%和27.45%。顛換類型中，G→C發(fā)生頻率最高，分別為13.94%和13.84%%?？赡苁且?yàn)镃G中的C（胞嘧啶）常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為T （胸腺嘧啶）。

2.3.2 SNP位置分析。對(duì)太平雞回腸SNP轉(zhuǎn)錄組序列位置變異類型進(jìn)行分析，CT組和MP組總的SNP位點(diǎn)分別為4 684 072和4 647 171個(gè)，其中位于內(nèi)含子和基因間區(qū)的SNP位點(diǎn)最多，位于內(nèi)含子的SNP位點(diǎn)在CT組占59.69%，MP組中占59.94%。位于基因間區(qū)的SNP位點(diǎn)在CT組占20.56%，MP組中占20.12%。另外，在基因組中不同的2個(gè)位置間，存在著共有的SNP位點(diǎn)，CT組中，3′-UTR與5′-UTR中共有的SNP位點(diǎn)為603個(gè)，上游區(qū)與下游區(qū)共有的有3940個(gè)，外顯子與剪接位點(diǎn)中的為66個(gè);MP組中，3′-UTR與5′-UTR中共有的SNP位點(diǎn)為606個(gè)，上游區(qū)與下游區(qū)共有3 879個(gè)，外顯子與剪接位點(diǎn)中的SNP位點(diǎn)為70個(gè)，如圖3所示。

2.3.3 SNP功能類型分析。

對(duì)太平雞回腸SNP的功能類型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要存在一些小規(guī)模的突變，其中同義突變SNP占比最高，CT組為7.01%，MP組占比為7.10%;非同義突變SNP在CT組中占比為2.97%，MP組占比為2.98%。其他突變既移碼缺失、終止密碼突變、非移碼缺失、移碼插入、非移碼插入的SNP位點(diǎn)相繼減少，另外CT組和MP組中分別存在未知功能的58個(gè)SNP位點(diǎn)（圖4）。

3 討論

新一代的測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)后，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選獲得SNP已成為開發(fā)應(yīng)用于遺傳多樣性分析、分子育種等分子標(biāo)記的重要技術(shù)手段，此技術(shù)相較于基因組篩序獲得分子標(biāo)記，不僅能大大降低成本，且能快速精且能快速精準(zhǔn)地獲得具有較高通用性的有用序列，使得開發(fā)利用分子標(biāo)記更加有效便捷[15-16]。

該研究對(duì)太平雞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了初步研究，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)太平雞的回腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)太平雞SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，MP共獲得SNP位點(diǎn)數(shù)4 647 171個(gè)，CT中含SNP 4 684 072個(gè)，SNP類型中轉(zhuǎn)換類型明顯高于顛換類型，MP和CT組中轉(zhuǎn)換類型分別達(dá)到27.46%和27.45%，理論上發(fā)生轉(zhuǎn)換的概率與發(fā)生顛換概率的比值應(yīng)該等于0.5 （1∶2），但有些生物的比值常常>0.5，這種差異被稱為“轉(zhuǎn)換偏差”[17]。該研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換概率約為顛換的1.98倍，大于理論值，說(shuō)明存在轉(zhuǎn)換偏差，這可能與堿基組成及進(jìn)化過(guò)程的選擇機(jī)制有關(guān)，表明堿基轉(zhuǎn)換突變并不是隨機(jī)產(chǎn)生[17]。另外，該研究發(fā)現(xiàn)G/A發(fā)生頻率在轉(zhuǎn)換類型中最高，這可能與在CG序列上出現(xiàn)的高頻率，胞嘧啶極易甲基化有關(guān)。

對(duì)太平雞回腸轉(zhuǎn)錄組序列SNP位置進(jìn)行分析，CT組和MP組總的SNP位點(diǎn)分別為4 684 072和4 647 171個(gè)，其中位于內(nèi)含子和基因間區(qū)的SNP位點(diǎn)最多，位于內(nèi)含子的SNP位點(diǎn)在CT組占59.69%，MP組中占59.94%。位于基因間區(qū)的SNP位點(diǎn)在CT組占20.56%，MP組中占20.12%。SNP可在DNA、RNA和蛋白質(zhì)不同水平影響基因的功能，尤其是位于編碼區(qū)域內(nèi)的編碼SNP （cSNP）與基因的表達(dá)相關(guān)，直接影響著功能基因的作用途徑[18]。通過(guò)cSNP分布情況以及功能分析可以得到許多與物種生長(zhǎng)發(fā)育性狀相關(guān)的重要資料[19]。位于基因調(diào)控區(qū)的SNP（pSNP）則會(huì)影響基因表達(dá)量[20]。因此，研究這兩類SNP在太平雞的功能和疾病發(fā)生發(fā)展方面具有更重要的意義。

對(duì)太平雞突變類型的功能SNP進(jìn)行分析，同義突變SNP占比最高，CT組中為7.01%，MP組中占7.10%;非同義突變SNP在CT組中占比為2.97%，MP組中占2.98%。其他突變既移碼缺失、終止密碼突變、非移碼缺失、移碼插入、非移碼插入的SNP位點(diǎn)相繼減少。編碼區(qū)內(nèi)的同義SNP造成的編碼序列的變化不會(huì)引起氨基酸序列變化;而非同義SNP則會(huì)影響蛋白質(zhì)序列，導(dǎo)致生物性狀改變[21]。因此，開發(fā)太平雞編碼區(qū)非同義SNP具有重要的生物學(xué)意義。

從太平雞回腸轉(zhuǎn)錄組獲得的SNP位點(diǎn)標(biāo)記可以進(jìn)一步用來(lái)完成后續(xù)群體的進(jìn)化分析和特異性SNP標(biāo)記的開發(fā)，對(duì)太平雞進(jìn)行遺傳改良，資源鑒定分析、高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、提高養(yǎng)殖效益和健康化養(yǎng)殖水平以及分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

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