黃 犀，王歡利，嚴(yán)靈君，羅會(huì)婷，湯詩(shī)杰

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所， 江蘇 南京 210014)

南京椴(TiliamiquelianaMaxim)屬椴樹科椴樹屬，是少數(shù)以南京命名的樹種之一，為我國(guó)特有種[1-2]。南京椴應(yīng)用價(jià)值廣泛，不僅可用于園林觀賞，作為蜜源，還具有一定的生態(tài)價(jià)值和文化價(jià)值[3-4]。然而，南京椴資源十分有限，國(guó)內(nèi)主要集中在江蘇、安徽和浙江等地，呈點(diǎn)狀分散分布，群體數(shù)量較少，自然更新能力差，種群結(jié)構(gòu)呈衰退型，部分種群僅有少數(shù)單株散生于林間，種群極不穩(wěn)定；加之南京椴生境受人為破壞嚴(yán)重，群體數(shù)量及個(gè)體數(shù)量不斷減少[5-8]。目前，南京椴的育苗繁殖工作仍處于起步階段，其研究主要集中于種子發(fā)芽[9-10]、扦插繁殖[11-12]與直接器官發(fā)生的組織培養(yǎng)[13-15]方面。國(guó)內(nèi)椴屬植物研究中，僅有少量關(guān)于南京椴愈傷組織誘導(dǎo)的研究報(bào)道[16]。究其原因，主要是南京椴分布范圍不斷縮小，社會(huì)認(rèn)知度不高，其應(yīng)用價(jià)值沒(méi)有被充分挖掘和利用，而批量化繁育南京椴種苗的企業(yè)則傾向于通過(guò)簡(jiǎn)單增加播種量的方式提高育苗量，對(duì)其他繁育方式關(guān)注度不高。本研究旨在通過(guò)摸索植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、光照和外植體等條件，簡(jiǎn)化并明確南京椴胚性愈傷組織誘導(dǎo)所需的條件，為種苗繁育和遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持，為種質(zhì)資源的保存和創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 外植體選擇試驗(yàn)

試驗(yàn)材料選取江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所繼代保存的南京椴組織培養(yǎng)無(wú)菌幼苗[15]。在長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)菌苗高度5 cm左右時(shí)，分別剪下葉片、莖和葉柄。選取的葉要盡量大，以便后續(xù)切割，選取的莖段應(yīng)盡量長(zhǎng)且粗壯。同批次無(wú)菌苗的葉片、莖和葉柄以手術(shù)刀分離后，將葉片切成大小為1.5 cm2左右的小塊，葉柄和莖段則切成長(zhǎng)1.5 cm左右的小段。將各外植體分別接種于培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)瓶于紙箱中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的暗培養(yǎng)，溫度在24 ℃左右。待有愈傷組織長(zhǎng)出后，轉(zhuǎn)入相應(yīng)強(qiáng)度的光照下培養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及他人研究結(jié)果[16]，選擇在光照培養(yǎng)后第20天進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)出愈率、褐化率和死亡率分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(n>30)。出愈率(%)=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù))×100；褐化率(%)=(褐化的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù))×100；死亡率(%)=(死亡的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù))×100。

1.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑篩選試驗(yàn)

愈傷組織誘導(dǎo)及其繼代培養(yǎng)在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基添加30 g/L蔗糖與8 g/L瓊脂后，分別加入對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，pH調(diào)整在5.8—6.0，每個(gè)培養(yǎng)瓶中分裝40 mL，在121 ℃下滅菌20 min。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比見(jiàn)表1。

表1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度 mg/L

1.3 光照強(qiáng)度選擇試驗(yàn)

待愈傷組織長(zhǎng)出后，放入光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為MS+ 0.1 mg/LBA+1.5 mg/L 2,4-D，光照度分別為低光照強(qiáng)度(500 lx)和高光照強(qiáng)度(2 000 lx)。使用不同層數(shù)的半透明黑塑料膜包裹培養(yǎng)瓶以獲得不同光照強(qiáng)度，使用光照強(qiáng)度計(jì)(HANNA,HI97500)測(cè)定相應(yīng)光照強(qiáng)度。比較在高光照強(qiáng)度下培養(yǎng)20 d后,再轉(zhuǎn)入低光照強(qiáng)度培養(yǎng)3，6，10 d時(shí)，愈傷組織的褐變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方中不同外植體來(lái)源的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

不同培養(yǎng)基配方中不同外植體來(lái)源的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見(jiàn)表2，其出愈率、褐化率、死亡率的結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析如表3?？梢钥闯觯?,4-D和6-BA對(duì)于南京椴誘導(dǎo)愈傷組織是必需的。但是高質(zhì)量濃度或者低質(zhì)量濃度的2,4-D對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)都會(huì)產(chǎn)生負(fù)面的影響。在2,4-D質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織的效果最佳。

表2 不同培養(yǎng)基配方中各種外植體愈傷組織誘導(dǎo)狀況

表3 不同培養(yǎng)基配方中出愈率、褐化率及死亡率 %

A配方為不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)階段各外植體均沒(méi)有任何愈傷組織形成，轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)階段后部分外植體死亡；在含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理組中，D配方3種外植體的出愈率均為100.00%,且死亡率均為0，但其褐化率分別為葉柄7.46%、莖段10.94%及葉片7.69%;C配方出愈率略低，分別為葉柄100.00%、莖段96.97%(64/66)及葉片89.55%(60/67)，但愈傷褐化率均為0，死亡率分別為葉柄0、莖段0及葉片4.48%；B，E配方的出愈率接近，均未超過(guò)90%，C配方褐化率較低，死亡率較高，而E配方則相反，褐化率在所有配方中是最高的，但其愈傷死亡率均為0。

2.2 不同外植體對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

由表4可以看出，3種外植體的誘導(dǎo)情況具有一定差異，葉柄的出愈率為73.25%，高于莖段和葉片，后2者出愈率接近，分別為68.13%和68.29%。而死亡率則相反，葉片最高為14.94%，其次為莖段13.13%，最低為葉柄12.77%。莖段褐化率最高，為5.00%，葉柄和葉片褐化率分別為3.65%和3.66%。

表4 不同外植體的誘導(dǎo)結(jié)果

2.3 光照條件對(duì)南京椴愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在暗培養(yǎng)之后的光培養(yǎng)過(guò)程中，低光照強(qiáng)度(500 lx)的培養(yǎng)明顯減緩了愈傷組織的褐化(見(jiàn)表5)。直接轉(zhuǎn)入高光照強(qiáng)度(2 000 lx)的愈傷組織，在培養(yǎng)20 d后，褐化率為80%。隨著低光強(qiáng)度培養(yǎng)時(shí)間的增加，褐化率逐漸下降。3 d低光強(qiáng)度培養(yǎng)組的褐化率為26.67%，6 d后的褐化率為16.67%，9 d后的褐化率為13.33%。

表5 不同光照條件下愈傷組織褐化率

3 結(jié)論與討論

2020年度國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目指南專門指出：一些重要領(lǐng)域如森林培育學(xué)、經(jīng)濟(jì)林學(xué)和林木遺傳育種學(xué)等未能凝練出本領(lǐng)域重要的基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題，林木遺傳育種研究缺少完善的輔助育種和早期選擇體系，關(guān)于基因同源克隆及異源功能驗(yàn)證項(xiàng)目仍舊多屬跟蹤性研究，存在同質(zhì)化現(xiàn)象[17]。這一問(wèn)題在南京椴遺傳育種及基礎(chǔ)研究里十分突出，目前已發(fā)表的各項(xiàng)研究?jī)H限于對(duì)其生理生化方面的分析討論，分子生物學(xué)相關(guān)研究工作尚處于起步階段。雖然目前對(duì)南京椴的研究不夠深入，但及時(shí)建立一個(gè)成熟的南京椴同源轉(zhuǎn)化體系不僅可以方便分子生物學(xué)研究工作的開(kāi)展與深入，完成對(duì)南京椴重要基因的功能驗(yàn)證，更能加速種質(zhì)資源創(chuàng)新速度，成為南京椴林木育種的加速器。同時(shí)也可以在此基礎(chǔ)上為其他椴樹屬植物的同源轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建提供借鑒。而提供大量合格愈傷組織，則是建立南京椴同源轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)。

本研究旨在通過(guò)摸索植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件、光照條件和外植體條件，簡(jiǎn)化南京椴胚性愈傷組織誘導(dǎo)需要的外部因素，從而能為下一步體胚誘導(dǎo)試驗(yàn)生產(chǎn)合格愈傷組織。同類型工作之前僅劉芳在其碩士學(xué)位論文中進(jìn)行了探索[16]。

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度配比條件對(duì)南京椴愈傷誘導(dǎo)的影響有決定性作用。研究表明，許多木本植物的愈傷組織誘導(dǎo)需要2,4-D的參與[18-20]。本研究結(jié)果分析表明，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上30 g/L蔗糖和8 g/L瓊脂后，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度為 0.1 mg/L BA + 2.0 mg/L 2,4-D 的培養(yǎng)基配方對(duì)誘導(dǎo)南京椴愈傷組織的誘導(dǎo)率最高、死亡率最低，但褐化率在7.46%—10.94%。 0.1 mg/L BA+1.5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基配方對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率次高，為89.55%—100%，但其褐化率均為0，且死亡率僅葉片有4.48%，其余2種外植體均為0。劉芳在試驗(yàn)中使用了BA+2,4-D及BA+NAA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，分別進(jìn)行濃度梯度差異試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BA+NAA無(wú)法誘導(dǎo)愈傷形成；而BA+2,4-D組合中，2,4-D的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間為0.5—1.0 mg/L。其2,4-D的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間與本試驗(yàn)結(jié)論略有差異，可能與使用外植體材料的生理狀態(tài)及物種基因型有關(guān)。

在外植體的選擇上，葉柄要比葉片和莖段在出愈率、褐化率上更加適合作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。但組織培養(yǎng)生產(chǎn)的無(wú)菌葉片數(shù)量上要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于葉柄，大批量生產(chǎn)愈傷組織時(shí)，葉片也可作為外植體加以使用。劉芳試驗(yàn)則選擇葉片、莖段及根尖作為外植體來(lái)源，認(rèn)為葉片最適宜作為外植體，但其試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)葉片近葉柄部位誘導(dǎo)速度最快，愈傷組織質(zhì)量最好。

組織培養(yǎng)褐變的成因是復(fù)雜的，外植體材料的生理狀態(tài)、基因型、生長(zhǎng)部位與大小，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度與光照等多種因素，都會(huì)導(dǎo)致褐變的發(fā)生。多酚氧化酶(PPO)在受傷組織中的活性升高，通過(guò)作用于酚類物質(zhì), 將其氧化為醌類物質(zhì), 從而引起外植體和愈傷組織褐化[21-22]。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或吸附劑，是防止外植體褐變的有效方法。劉芳在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑 Vc，發(fā)現(xiàn)在暗培養(yǎng)條件下，Vc 的抗褐化效果較好，能夠有效控制愈傷組織褐化現(xiàn)象；但光培養(yǎng)條件下，基本不能發(fā)揮抗褐化的功效。研究表明，低溫馴化也可以顯著提高某些植物愈傷組織的抗氧化酶活性[23]。本試驗(yàn)從簡(jiǎn)化愈傷組織誘導(dǎo)的外部條件考慮，選擇2種不同光照度條件進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)過(guò)早、過(guò)高的光照培養(yǎng)，對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有顯著負(fù)作用，高光照度條件下，愈傷組織死亡率及褐化率均高于低光照度條件。

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，以葉柄為外植體，在MS+ 0.1 mg/L BA+ 1.5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)10 d后在光照強(qiáng)度500 lx下光培養(yǎng)5—7 d，然后再轉(zhuǎn)到正常光照(2 000 lx)培養(yǎng)，為高效誘導(dǎo)南京椴愈傷組織的方法。