熊鳳梅，孔令恒，孫 娜，丁 輝，石曌玲

川崎病(Kawasaki disease, KD)，又被稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種常見于5歲以下嬰幼兒，以全身非特異性中、小動(dòng)脈血管炎性反應(yīng)為主要病理特點(diǎn)的急性發(fā)熱性、出疹性疾病，病因不明，易侵害冠狀動(dòng)脈進(jìn)而引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和冠狀動(dòng)脈瘤，嚴(yán)重危害患兒的心臟功能[1-3]。流行病學(xué)結(jié)果顯示，KD發(fā)病率逐年升高，并且已經(jīng)取代風(fēng)濕熱成為嬰幼兒獲得性心臟病的主要原因之一[4]。部分KD患兒還會(huì)出現(xiàn)血栓栓塞、心肌炎或心肌梗死[5,6]，加之KD繼發(fā)的心肌損傷的病因和具體機(jī)制未完全闡明，這使得臨床上至今還未有針對KD誘發(fā)心肌損傷的有效治療方法。因此，有必要探討KD誘發(fā)心肌損傷的機(jī)制并尋找有效的治療藥物和潛在的治療靶點(diǎn)，為臨床上治療KD心肌損傷提供理論依據(jù)。

白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種存在于葡萄、桑葚、花生和多種中藥材中的多酚類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為3,5,4′-三羥基二苯乙烯，由于其具有明顯的抗腫瘤、抑制炎性反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)活性及心血管保護(hù)作用，受到了廣泛關(guān)注[7-10]。Notch信號通路是一類進(jìn)化高度保守的跨膜受體家族，由配體、受體和下游分子組成，在胚胎期和成年后細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，該通路的活化還參與炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激過程[11-13]。有研究表明，Notch1可減輕心肌缺血損傷，改善心肌梗死后心臟功能，并在梗死區(qū)修復(fù)中發(fā)揮重要作用[14]。然而Notch信號通路是否在KD誘發(fā)的心肌損傷中有變化，是否介導(dǎo)Res改善KD誘發(fā)心肌損傷的作用還不清楚。因此，本研究擬采用幼年雄性SD大鼠KD模型，即腹腔注射干酪乳酸桿菌胞壁成分(lactobacillus casei cell wall extract, LCWE)制備KD，并探討Res對KD誘發(fā)心肌損傷的保護(hù)作用以及對Notch信號通路的調(diào)控，為闡明KD誘發(fā)心肌損傷的機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 幼年雄性SD大鼠(4周齡)48只，體重80～100 g，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Bax、Bcl2、Notch1和Hes1抗體均購買于Cell Signaling Technology公司，GAPDH購于谷歌生物科技有限公司(武漢)；TNF-α和IL-1β含量檢測試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)公司；RIPA裂解液購于碧云天生物技術(shù)有限公司(上海)；蛋白酶抑制劑購買于Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher公司；Res購于Sigma公司(上海)；干酪乳酸桿菌(Lactobacillus case)購于工業(yè)微生物菌種保藏中心；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基和鼠李糖定量試劑盒購于上海廣銳生物科技有限公司。

1.2 制備KD模型 首先培養(yǎng)干酪乳酸桿菌，采用文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法：將購買的干酪乳酸桿菌菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，并在37 ℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)2 d；將培養(yǎng)基以5000 g離心20 min，棄上清，沉淀中加入40 g/L SDS過夜以充分裂解。以5000 g離心裂解液30 min，PBS洗滌后，加入RNA酶(250 μg/ml)混勻，37 ℃孵育4 h，離心棄上清，重復(fù)3次。再加入DNA酶(250 μg/ml)混勻，37 ℃孵育4 h，離心棄上清，重復(fù)3次。最后沉淀中加入胰蛋白酶(250 μg/ml)，37 ℃孵育4 h，離心棄上清，重復(fù)3次。用PBS將沉淀重懸，超聲破碎儀冰上破碎2 h，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 12 000 g離心1 h，上清即為LCWE。采用比色法定量，并將LCWE終濃度稀釋為1 mg/ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 幼年雄性SD大鼠(4周齡)48只，隨機(jī)分為對照組、Res對照組(Res組)、KD模型組(KD組)和Res處理KD組(Res+KD組)；其中，對照組大鼠僅腹腔注射0.5 ml生理鹽水，Res組僅腹腔注射Res(100 mg/kg)，KD組大鼠腹腔注射0.5 ml LCWE(1 mg/ml)，Res+KD組大鼠腹腔注射0.5 ml LCWE(1 mg/ml)和Res(100 mg/kg)。每天監(jiān)測大鼠的生存狀況，包括體重、飲水、飲食和活動(dòng)狀況等。在造模后28 d結(jié)束實(shí)驗(yàn)取材，并檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 小動(dòng)物超聲檢測各組心臟功能 4%異氟烷麻醉大鼠，并將大鼠仰臥位固定在Visual Sonics Vevo 2100小動(dòng)物超聲儀加熱板上，將恒溫加熱板溫度設(shè)定為37 ℃。將左胸前被毛脫去后開始檢測。用探頭置于大鼠左胸前，在乳頭肌水平位置用M型取樣線監(jiān)測心率，測量收縮期左室內(nèi)徑、舒張期左室內(nèi)徑等指標(biāo)，并經(jīng)計(jì)算得到左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)。

1.5 HE染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將各組大鼠心臟取下放入PBS中清洗，再固定于4%多聚甲醛中過夜，采用常規(guī)脫水復(fù)蠟方法進(jìn)行石蠟包埋，并切成3 μm厚的薄片，然后行常規(guī)HE染色步驟，光鏡下觀察各組心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 心肌組織TNF-α和IL-1β含量檢測 各組均稱取50 mg的心肌組織并放入離心管中，加入1 ml預(yù)冷的PBS，用眼科剪將心肌組織剪成小塊，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 3000 g離心5 min，棄上清，沉淀中加入RIPA裂解液(質(zhì)量/體積比1∶5)和蛋白酶抑制劑，在冰上將心肌組織充分研磨并裂解30 min，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 12 000 g離心30 min，吸取上清，棄沉淀。按照TNF-α含量檢測說明書，采用分光光度計(jì)在450 nm處測量吸光值并根據(jù)說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組心肌組織中TNF-α含量；按照IL-1β含量檢測說明書，在450 nm處檢測吸光值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組心肌組織中IL-1β含量。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組稱取50 mg重量的心肌組織并放入離心管中，加入1 ml預(yù)冷的PBS，用眼科剪將心肌組織剪成小塊，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 3000 g離心5 min，棄上清，沉淀中加入RIPA裂解液(質(zhì)量/體積比1∶4)和蛋白酶抑制劑，在冰上將心肌組織充分研磨并裂解30 min，低溫高速離心機(jī)4 ℃ 12 000 g離心30 min，吸取上清，棄沉淀；采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，采用常規(guī)電泳和濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h，將條帶放入相應(yīng)的Bax抗體(1∶1000)、Bcl2抗體(1∶1000)、Notch1抗體(1∶1000)、Hes1抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶5000)中，搖床4 ℃過夜孵育；TBST洗膜5次，6 min/次，將條帶放入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜5次，6 min/次，用ECL顯色液避光檢測，Image Lab統(tǒng)計(jì)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 Res改善KD誘發(fā)的心臟功能障礙 超聲結(jié)果顯示，和對照組比較，Res組大鼠心臟功能沒有明顯變化；和對照組比較，KD組大鼠心臟LVEF和LVFS顯著降低(P<0.05)；而和KD組比較，Res+KD組大鼠心臟LVEF和LVFS明顯升高(P<0.05，圖1和表1)。

圖1 各組大鼠心臟超聲原始圖

表1 各組川崎病大鼠誘發(fā)心臟LVEF和LVFS的比較

2.2 Res減輕KD誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡 Western blot和TUNEL染色結(jié)果顯示，和對照組比較，Res組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)無明顯變化；和對照組比較，KD組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量和Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；而和KD組比較，Res+KD組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量和Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl2蛋白表達(dá)增加(P<0.05，圖2，表2和圖3)。

圖2 各組川崎病大鼠誘發(fā)心肌損傷Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果

表2 各組川崎病大鼠心肌組織Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的比較

圖3 各組川崎病大鼠心臟TUNEL染色結(jié)果

2.3 Res減輕KD引起的心肌組織炎性反應(yīng) HE染色和ELISA結(jié)果顯示，對照組和Res組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌組織中TNF-α和IL-1β含量無明顯差異；和對照組比較，KD組心肌纖維排列紊亂，并出現(xiàn)部分?jǐn)嗔眩募〗M織中TNF-α和IL-1β含量顯著增加(P<0.05)；而和KD組比較，Res+KD組心肌纖維排列改善，斷裂減輕，心肌組織中TNF-α和IL-1β含量明顯降低(P<0.05，圖4和表3)。

圖4 各組川崎病大鼠心臟HE染色結(jié)果(200×)

表3 各組川崎病大鼠心肌組織Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的比較

2.4 Res激活KD心肌組織中Notch1/Hes1信號 Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組比較，Res組大鼠心肌組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)沒有明顯差異；和對照組比較，KD組心肌組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；和KD組比較，Res+KD組心肌組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05，圖5和表4)。

圖5 各組川崎病大鼠誘發(fā)心肌損傷Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果

表4 各組川崎病大鼠心肌組織Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

川崎病已經(jīng)成為嬰幼兒獲得性心臟病的主要原因之一，作為一種急性、發(fā)熱性和出疹性疾病，由于病因和機(jī)制不明，使其成為臨床診斷和治療的難點(diǎn)。KD主要以非特異性血管炎為病理特征，對冠狀動(dòng)脈的侵害尤為嚴(yán)重，對患兒心血管系統(tǒng)直接或間接的損害是KD引發(fā)損傷甚至導(dǎo)致死亡的重要原因[16]。為了進(jìn)一步闡明KD的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療尋找潛在的藥物和可能的治療靶點(diǎn)，本研究利用LCWE制備幼年雄性SD大鼠KD模型，觀察了Res對KD誘發(fā)心肌損傷的保護(hù)作用和機(jī)制，證明Res可通過激活Notch1/Hes1信號，減輕心肌細(xì)胞凋亡和心肌炎性反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)KD心肌損傷的作用。

幼年雄性SD大鼠腹腔注射LCWE制備的KD模型，是目前實(shí)驗(yàn)室比較常用的動(dòng)物模型，為闡明KD病因及其對心血管損傷的分子機(jī)制提供了重要手段[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，KD組大鼠心臟LVEF和LVFS明顯降低，同時(shí)，心肌組織Bcl2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，心肌組織炎性分子TNF-α和IL-1β含量顯著增加，這些結(jié)果說明，KD組大鼠心臟功能障礙，心肌細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)明顯增加。

Res是從多種天然植物中提取的多酚類化合物，在抗衰老、降脂、抗氧化、抗癌、抗炎性反應(yīng)和改善心血管疾病等方面均具有生物學(xué)活性，尤其是在心血管保護(hù)方面受到了廣泛關(guān)注。有研究表明，Res能改善血管內(nèi)皮功能紊亂，抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位，減輕細(xì)胞炎性反應(yīng)[17]。同時(shí)，Res還能通過調(diào)控NF-κB、Sirt1、Nrf2或AMPK等分子在心肌梗死、缺血/再灌注損傷和心力衰竭等疾病的進(jìn)展過程中發(fā)揮保護(hù)作用[18,19]。本研究在成功制備KD模型的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步觀察了Res對KD誘發(fā)心肌損傷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Res處理KD組大鼠心臟LVEF和LVFS得到改善，心肌組織Bcl2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)也明顯降低，同時(shí)，心肌組織炎性分子TNF-α和IL-1β含量明顯降低，這些結(jié)果說明，Res可以改善KD組大鼠心臟功能障礙，并減輕KD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。

Notch1/Hes1信號在組織器官發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，而Hes1是Notch信號下游重要的靶基因[11]。越來越多的研究表明，Notch1/Hes1信號在心血管疾病中扮演重要的角色[12,20]。因而，我們又觀察了Notch1/Hes1信號在Res改善KD誘發(fā)心肌損傷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KD組心肌組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)均顯著降低，而給予Res處理后，可明顯上調(diào)Notch1和Hes1蛋白表達(dá)。這些結(jié)果說明，Res能夠激活KD引起的Notch1/Hes1信號抑制發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

總之，本研究進(jìn)一步明確了Res在KD誘發(fā)心肌損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其作用與Res減輕KD導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡和降低心肌組織炎性反應(yīng)有關(guān)，而Res發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與激活Notch1/Hes1信號有關(guān)。這為臨床上預(yù)防和治療KD誘發(fā)的心肌損傷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和策略。