李 飆,馬海明*
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410000)
多不飽和脂肪酸(ployunsatura tedfatty acids, PUFA)是機體不可缺少的必需脂肪酸,而長鏈(≥C20)多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)具有PUFA的高度生物活性形式,其生物學(xué)功能以及與機體健康的關(guān)系一直是國際關(guān)注和研究的熱點。大量研究表明,PUFA更具體地說,n-3 LC-PUFA,如二十碳五烯酸(EPA;20∶5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA;22∶6n-3)不僅參與信號傳遞和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞分裂[1]以及相關(guān)基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用,還能預(yù)防動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展、預(yù)防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病,被稱為“血管清道夫”[2]。飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸可以被所有生物體生物合成,而PUFA通常必須在動物的飲食中獲得,盡管它們可以在某些物種中轉(zhuǎn)化為長鏈(C20-24) PUFA (LC-PUFA)。C18 PUFA利用有氧前端脂肪酸去飽和酶(Fads)和脂肪酸延長酶(ElovL)的途徑生成LC-PUFA[3](如圖1)。該途徑中最不飽和的產(chǎn)物DHA和22∶5n-6的底物分別為18∶3n-3和18∶2n-6。所涉及的酶對n-3和n-6系列脂肪酸均有作用,一般都偏愛n-3。以n-3例,EPA的生成需要Δ6去飽和酶和Δ5去飽和酶分別從α-亞麻酸(ALA;18∶3n-3)去飽和生成18∶4n-3,從20∶4n-3去飽和生成EPA[4];另一個途徑是ALA延長生成20∶3n-3 后緊接著通過Δ8和Δ5去飽和酶去飽和作用生成EPA[5,6]。在某些魚類,可以直接通過EPA延伸產(chǎn)物22∶5n-3利用Δ4去飽和酶生產(chǎn)DHA[7]。但在哺乳動物中,從EPA到DHA似乎涉及到一個更復(fù)雜的路徑,該途徑是脊椎動物中最普遍的DHA生物合成途徑——“Sprecher通路”,EPA需要連續(xù)兩個碳鏈延長產(chǎn)生24∶5n-3,然后通過△6-脫氫酶的去飽和作用生成24∶6n-3,最后通過過氧化物酶催化脂肪酸的β-氧化縮短碳鏈生成二十二碳的DHA[8]。另一種是“Δ4去飽和酶通路”,△4 途徑一般發(fā)生在低等生物中,是 EPA 轉(zhuǎn)化為 DHA 的主要途徑,然而Hui Gyu Park等人[9]在細(xì)胞中證實,二十二碳五烯酸(DPA ,22∶5n-3)和 腎上腺 酸(ADA,22∶4n-6)直接通過FADS2基因產(chǎn)物通過△4脫氫形成不飽和鍵,分別生成 DHA,這為探究FADS2基因功能提供一條新思路。然而兩種途徑都首先需要乙酰輔酶 A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase,ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)兩種胞質(zhì)酶進行合成,然后在脂肪?;ワ柡兔福‵ads)和超長鏈脂肪酸(ElovL)蛋白的兩組酶的協(xié)同作用下對脂肪酸進一步延長和去飽和,從而獲得碳鏈較長的不飽和脂肪酸[10]。
MicroRNA(miRNA) 是 一類內(nèi)源的、進化保守的小非編碼RNA,其長度約為22個核苷酸(nt)。具有典型的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu),在真核生物的基因組上,最初RNA聚合酶II從基因間區(qū)域或重疊基因(蛋白質(zhì)編碼或非編碼)中編碼的初級轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄為初級miRNA(pri-miRNA)。然后裂解核酸內(nèi)切酶Drosha,在細(xì)胞核內(nèi)形成前體miRNA(pre-miRNAs, 約 70 nt)。然后,前miRNA被另一種內(nèi)切酶Dicer處理,在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生22 nt長度的具有功能的 miRNA成熟體。與長鏈非編碼RNA、環(huán)狀非編碼RNA和 pi RNA等其他非編碼RNA相比,mi RNA的調(diào)控機制相對簡單。通常,成熟的miRNA通過其“種子區(qū)”(miRNA的5'端的2~8個核酸序列)能夠與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3' UTR)部分或完全互補結(jié)合,使mRNA不穩(wěn)定,翻譯延遲或抑制目標(biāo)基因的表達(dá)[11]。在哺乳動物物種中,據(jù)估計只有1%~5%的基因組轉(zhuǎn)錄本編碼miRNA,但是多達(dá)60%的基因直接或間接受miRNA調(diào)控。目前在動物上發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的 miRNA 在不斷增多。有人提出一種miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百種mRNA的表達(dá),而一種mRNA的表達(dá)又可以同時被數(shù)百種miRNA調(diào)節(jié)。換句話說,miRNA可以通過在生物體中構(gòu)建復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng),憑借對大量靶基因的調(diào)控,miRNA 參與機體內(nèi)的多種生命活動,除了細(xì)胞的增殖、分化、死亡、應(yīng)激反應(yīng)、胞內(nèi)代謝和信號傳導(dǎo)[12,13]。同時越來越多的研究表明,miRNA在脂質(zhì)代謝中起著重要的調(diào)控作用。例如,在哺乳動物肝臟中大量表達(dá)的miR-122可以特異性通過靶向陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1(Cpt1α)的調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)肝臟蛋白質(zhì)的代謝;同時還可以通過抑制參與膽固醇生物合成的基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸和膽固醇的合成[14]。此外,miR-33a/b靶向參與脂肪酸氧化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶,包括肉堿O-辛基轉(zhuǎn)移酶,肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A,羥酰基-CoA-脫氫酶,Sirtuin 6(SIRT6)和AMP激酶亞基-α,并協(xié)同調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài);miR-33a/b也靶向胰島素受體底物2,這是肝臟中胰島素信號通路的重要組成部分[15];miR-27a/b通過靶向PPARγ抑制脂肪細(xì)胞分化和甘油三酸酯的積累,參與肥胖中的脂肪組織失調(diào),表明脂質(zhì)代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后沉默調(diào)控的另一重要元素需要依賴 miRNA[16,17]。
無論無脊椎動物還是豬、牛等脊椎動物,都擁有編碼LC-PUFA生物合成途徑中涉及的去飽和酶和延長酶的基因,盡管其確切的功能和受到非編碼RNA調(diào)控功能仍有待闡明。
生物血液和組織PUFA濃度由膳食攝入和內(nèi)源性合成共同決定,通過膳食前體亞油酸(18:2n-6,LA)和a-亞麻酸(18:3n-3, ALA)的連續(xù)伸長和去飽和。Δ5去飽和酶和Δ6去飽和酶參與了這一酶過程,分別由兩個同源直系基因FADS1和FADS2基 因 編 碼。FADS1和FADS2基因與FADS3基因位于染色體11q12-q13.1上的一個簇中。該基因簇由92 kb組成,頭對頭方向為FADS1和FADS2,尾對尾方向為FADS2和FADS3。FADS1和FADS2的內(nèi)含子1被一個11.4 kb的區(qū)域隔開,F(xiàn)ADS3位于FADS2的6.0 kb端 粒 側(cè)[18]( 如 圖2)。FADS3的生物學(xué)功能尚不清楚。
肝臟是參與PUFA生物合成的主要器官,也是FADS1和FADS2表達(dá)的主要部位[19]。Li等[20]在研究20周齡和30周齡母雞的肝臟microRNA表達(dá)差異中,首次發(fā)現(xiàn)FADS1被 miR-365-3p,miR-218-5p,miR-181a-5p,miR-181b-5p,miR-29a-3p和miR-23b-3p靶向,而FADS2被miR-30c-1-3p靶向。這項研究為miRNA在脂質(zhì)代謝分子調(diào)控系統(tǒng)中的詳細(xì)功能提供了基礎(chǔ)資源。Zhang等[21]通過雙熒光素酶報告證明了,mir - 17在河豚原代肝細(xì)胞(Schl)中直接靶標(biāo)Δ4 FAD的3'UTR,影響了FAD1和FADS2的表達(dá),參與了LC-PUFA生物合成的調(diào)控。除了直接靶向以外,還有間接調(diào)控FADS上游基因。他還發(fā)現(xiàn)miR-33在Schl中靶向胰島素誘導(dǎo)的基因1(insig1),阻斷了LC-PUFA生物合成的激活因子甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(Sembp 1)的蛋白水解激活,從而抑制LC-PUFA生物合成的關(guān)鍵酶Δ4、Δ6、Δ5脂酰去飽和酶(FADs)的表達(dá)[22]。除此之外,Chen等也發(fā)現(xiàn)通過 Insig1/Srebp1 通路軸調(diào)控LC-PUFA生物合成的還有miR-24[23]。
在豬等脊椎動物中,無論是胚胎時期,還是出生后及成年,每個生命時期的肝代謝程序轉(zhuǎn)換是一個復(fù)雜的分子調(diào)控系統(tǒng)。例如,剛孵出的小雞在孵化后這些卵黃脂質(zhì)會迅速消耗殆盡,新陳代謝轉(zhuǎn)化為由碳水化合物為基礎(chǔ)的能量來源,由于消化系統(tǒng)發(fā)育不良,不能像成年雞那樣有效地利用飼料[24];通過采用延遲喂養(yǎng)48 h來阻止肝臟代謝轉(zhuǎn)換,發(fā)現(xiàn)延遲喂養(yǎng)導(dǎo)致miR-20b表達(dá)增加,而其靶標(biāo)FADS1的表達(dá)相反地減少;表明在轉(zhuǎn)錄前后,F(xiàn)ADS1基因受到miRNA介導(dǎo),參與了這一轉(zhuǎn)換[25]。同時miR-33的表達(dá)顯著降低,miR-33是脊椎動物中著名的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑,已有報道在雞中被證明具有抑制肝臟脂肪酸氧化的作用[26],此結(jié)果進一步支持了miR-33在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝中的作用,表明它是雞代謝開關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。提示在肝代謝轉(zhuǎn)換時期,脂肪酸的從頭合成可以幾乎被抑制,這可能由于SREBF1及其下游FADS的表達(dá)減少所致,而miRNAs在這種代謝轉(zhuǎn)換過程中是肝臟代謝通路的關(guān)鍵調(diào)控因子。
脂肪酸延長酶(elongase of very long chain fattyacids, ELOVL)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜結(jié)合蛋白酶,主要參與延長循環(huán)反應(yīng)中的第一個縮合反應(yīng)[10]。哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的延長酶家族種類最多,含有7個成員,分別為 ELOVL1~ELOVL7,其對不同的脂肪酸底物表現(xiàn)出不同的底物特異性。ELOVL1、ELOVL3、ELOVL6和 ELOVL7 主要延長飽和以及單不飽和脂肪酸,但不參與長鏈PUFA的伸長[27];而ELOVL2、ELOVL4 和 ELOVL5 與魚類全長cDNA序列具有高度同源性,功能也具有相似性,主要催化多不飽和脂肪酸的延長反應(yīng)中C18和C20 PUFA 底物的碳鏈延伸[3,28,29]。
ELOVL2是長鏈多不飽和脂肪酸合成中的關(guān)鍵延長酶,其主要參與DHA前兩步合成過程,即由EPA轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸(DPA,22∶5n-3),以及進一步延長為24∶5n-3。然而,小鼠的ELOVL2能夠在一定程度上可延長18∶3n-6,而人類的ELOVL2則不能,這表明不同物種之間可能存在一些功能差異[3]。在人原發(fā)性肝細(xì)胞(PHHs)去分化的研究中,發(fā)現(xiàn)了ELOVL2在去分化PHHs中下調(diào),這與超長鏈PUFA濃度降低一致;此外,還發(fā)現(xiàn)在去分化過程中出現(xiàn)多種miRNA差異表達(dá),提示在PHHs去分化過程中miRNA通過調(diào)控ELOVL表達(dá)參與PHH脂質(zhì)的合成、積累和分泌[30]。
ELOVL2和ELOVL5酶在哺乳動物的大多數(shù)組織中普遍表達(dá)。盡管ELOVL5在大鼠中可能存在物種差異,在肺和大腦中表達(dá)最高,而人類的ELOVL5在睪丸和腎上腺中表達(dá)尤其高,其特征為22∶5n-6水平相對較高[31,32]。這兩個延長酶具有重疊的生理功能,ELOVL5能夠延長C18和C20 PUFA,但對C22沒有活性,而ELOVL2能夠延長C20和C22 PUFA,但ELOVL2和ELOVL5對飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸都沒有活性[4,33]。
許多研究證明ELOVL5對C18和C20為底物的脂肪酸的轉(zhuǎn)化活性具有重要性[10]。Chen等首次發(fā)現(xiàn)miR-146a可能通過靶向ELOVL5參與調(diào)控SCHL細(xì)胞LC-PUFA生物合成,并發(fā)現(xiàn)miR-146a過表達(dá)顯著降低了依賴于ELOVL5的PUFA延長指數(shù),如20∶3n-6/18∶3n-6、20∶4n-3/18∶4n-3、22∶5n-3/20∶5n-3,從而降低了SCHL細(xì)胞的LC-PUFA含量[34]。
已有文章報道ELOVL5通過參與控制脂肪細(xì)胞甘油三酯脂肪酶(也稱為蛋白樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域,patatin-like phospholipase domain)的豐度,從而調(diào)節(jié)甘油三酯(TG)水平來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[35];而在此脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)過程中miRNA 可能發(fā)揮了正向調(diào)控作用。Li等[36]通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出ELOVL5是miR-21-3p的靶基因,隨后實驗中被證實,在乳腺上皮細(xì)胞(MECs)中表達(dá)bta-miR-21-3p促進了甘油三酯的產(chǎn)生,這可能與靶基因ELOVL5的調(diào)控有關(guān)。除此之外, Zhang等[37]在雌性激素處理的產(chǎn)蛋期雞的原發(fā)性肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)6個miRNA顯著下調(diào),并且證實miR-218-5p可以直接靶向ELOVL5,發(fā)現(xiàn)雌激素可以上調(diào)ELOVL5的表達(dá),間接促進產(chǎn)蛋母雞肝臟中LCPUFA的合成,而此調(diào)控可能依賴與miRNAs。綜上所述,ELOVL5可被多個miRNA直接調(diào)控影響LCPUFA的合成,同時ELOVL5也可以受到其他因子保護不受miRNA介導(dǎo)的影響,這也間接說明了 ELOVL5在脂肪及碳水化合物的代謝的重要性[38]。
ELOVL6 的主要功能是催化單不飽和脂肪酸的合成,比如催化C16 脂肪酸延伸為 C18;其主要在肝臟、脂肪組織和腎上腺等脂質(zhì)含量較高的組織或器官中表達(dá)較高[3]。ELOVL6 基因是影響脂肪酸合成的關(guān)鍵基因,是將棕櫚酸轉(zhuǎn)化成進一步延伸成硬脂酸的限速酶;除此之外,ELOVL6還是參與維持機體脂肪酸代謝平衡的關(guān)鍵因子,在最新的研究中發(fā)現(xiàn)ELOVL6與胰島素抵抗[39],非酒精性脂肪肝[40]和肝炎動脈粥樣硬化[41]等發(fā)病機理有關(guān)聯(lián)。深入研究ELOVL6基因有助于了解肝臟中脂肪酸的組成變化機制。
已有報道ELOVL6在過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)和脂肪酸代謝信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[42]。ELOVL6 不僅可以直接調(diào)控機體的代謝作用,還可以在其他基因調(diào)控中發(fā)揮作用。在Hep G2細(xì)胞中碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein, ChREBP)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C (sterol regulatory elementbinding protein-1C, SREBP-1C)的異位共表達(dá)可以協(xié)同刺激ELOVL6啟動子;Moon 等[33]人研究發(fā)現(xiàn)ELOVL6 的表達(dá)還可以同時受到 SREBP-1和肝X受體α(LXRα)的直接調(diào)控,但SREBP-1a對ELOVL6的誘導(dǎo)作用更顯著[43]。此外,ELOVL6在不同動物組織中還可 以 被 miR-22-3P[44]、mir-144[45]、miRNA-125a-5p[46]等多種miRNA直接調(diào)控;當(dāng)ELOVL6表達(dá)被抑制時,棕櫚酸(C16∶0)含量顯著增加,而油酸(C18∶1,n-9),二十碳烯酸(C20∶1,n-9)和二十碳三烯酸(C20∶3)含量顯著降低,表明miRNAs可以影響ELOVL6的表達(dá)來調(diào)節(jié)一些細(xì)胞中飽和脂肪酸和長鏈不飽和脂肪酸的含量。不僅如此,在脂肪細(xì)胞的生長發(fā)育研究中,證實了ELOVL6為miR-204的直接靶基因,參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的成脂分化,猜測ELOVL6可能是mir-204與脂肪分化直接調(diào)節(jié)因子之間的中間調(diào)節(jié)因子[47]。
單不飽和脂肪酸是合成PUFA的底物。硬脂酰輔酶A去飽和酶(S tearoyl-CoA desaturease , SCD )也稱為Δ9去飽和酶,是肝細(xì)胞催化飽和脂肪酸 (saturated fatty acid, SFA) C9脫氫形成 n-9 系單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)的關(guān)鍵限速酶,分別轉(zhuǎn)化生成油酸 (OA,C18∶1)與棕櫚油酸 (PA,C16∶1)。多不飽和脂肪酸(PUFA)不僅是體內(nèi)能量的重要來源,而且是生物膜的重要組成成分。而這兩種物質(zhì)是合成膜磷脂和中性脂(包括甘油三酯和膽固醇酯等)的重要底物[48]。故SCD基因的表達(dá)或者酶活性的改變將會影響細(xì)胞內(nèi)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例,進而影響膜磷脂的組成,這對維持細(xì)胞膜的流動性及信號傳遞等很重要[49,50]。
有文章指出SCD表達(dá)變化與硬脂酸和油酸的比例改變直接相關(guān),這將會影響生物膜的流動性以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,進一步影響細(xì)胞的生長與分化[51]。除了已報道的共軛亞油酸、乙醇、類固醇激素等多種外源因素會影響肝臟SCD的活性外,許多內(nèi)源因子也會改變SCD 的功能表達(dá)[52]。Tan等[53]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可以直接靶向調(diào)控硬脂酰輔酶a去飽和酶(SCD)的表達(dá),從而抑制了3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累,并參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄、脂肪酸合成,尤其影響脂肪酸轉(zhuǎn)運的脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)顯著下降,而脂肪酸氧化過程得到了增強。SCD被直接靶向調(diào)控還有miR-125b[54]、miR-192[55]、miR-29a[56],均參與脂滴積累和MUFA的組成。除此之外,SCD還可以和脂肪酸合成酶(FAS)共同 被 miR-212-5p[57]、miR-27a[58]直接靶向,影響肝細(xì)胞甘油三酯(TG)的積累。
長鏈(≥C20)多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)具有PUFA的高度生物活性形式,在人類和其他動物的生理生化過程中發(fā)揮著重要作用。然而,在過去的十年中,大量的外源因子和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子被證明可以控制數(shù)百個與脂代謝相關(guān)的基因。其中,miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子參與脂質(zhì)代謝調(diào)控也受到人們越來越多的關(guān)注。筆者發(fā)現(xiàn)上述幾種LC-PUFA合成關(guān)鍵限速酶在不同物種不同組織中可以被多個miRNA調(diào)控,即使在同一細(xì)胞中也存在這種情況,說明可能存在其他內(nèi)源調(diào)控因子,但相關(guān)研究少之又少;并且大量研究集中于一種miRNA驗證工作,無法真實反應(yīng)miRNA在脂質(zhì)調(diào)控,尤其在不飽和脂肪酸合成代謝動態(tài)調(diào)控中的情況。
隨著研究技術(shù)不斷提高,將會有更多涉及PUFA合成的 miRNA 將被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)。已有大量報道中國地方品種豬肉質(zhì)好于瘦肉型豬種,究其原因中國地方豬種肌肉和脂肪中含有大量不飽和脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)。例如朱吉等對寧鄉(xiāng)豬肉質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其肌肉中肌內(nèi)脂肪高達(dá)5.37%,且 油 酸(18∶ 1)51.0%, 亞 油酸(18∶2)7.74%,飽和脂肪酸59.6%,遠(yuǎn)高于瘦肉品種,表明寧鄉(xiāng)豬種質(zhì)優(yōu)良、可塑性強[59]。研究中國地方豬肝臟、脂肪、肌肉組織中miRNA 的表達(dá)、功能以及其對PUFA合成關(guān)鍵酶的調(diào)控作用能夠深入揭示長鏈多不飽和脂肪酸合成及代謝的分子調(diào)控機制。這些研究工作一方面有助于開發(fā)脂代謝紊亂相關(guān)疾病的檢測標(biāo)志物和靶向診療藥物,另一方面有助于通過遺傳改良針對性地培育富含DHA、EPA等n-3 LC-PUFA的畜禽動物。不僅如此,隨著高通量測序技術(shù)不斷發(fā)展,深度挖掘LncRNA和CircRNA作為miRNA內(nèi)源競爭RNA參與PUFA合成及代謝調(diào)控也將成為今后研究熱點。