宋慶慶，佘志成，王 凱

（金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

口蹄疫、豬瘟、偽狂犬病等病毒性疾病，在我國流行時間及區(qū)域廣泛，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性傳染病，豬場通常采用疫苗免疫預防這三種疾病，但由于豬場豬病復雜繁多，需要接種的疫苗種類也很多，往往在制訂免疫程序時發(fā)生時間上的沖突。另外，研究表明非洲豬瘟病毒在相同感染劑量下，液體組和飼料組隨著暴露次數(shù)增加，豬群感染幾率也隨之增加，當液體組的暴露次數(shù)達到10次時，最低感染劑量（1 TCID50）的感染幾率接近100%。頻繁接觸豬只增加了非洲豬瘟的傳播風險，每次免疫，一豬一針頭，又會增加防疫人員的工作量。

為了更好地防控非洲豬瘟風險，解決減少免疫接種次數(shù)的同時又能達到同樣的免疫效果的矛盾，試驗結(jié)合實驗室檢測與臨床試驗，探索了用口蹄疫滅活疫苗稀釋偽狂犬病活疫苗和豬瘟活疫苗的組合免疫方案。實驗室通過測定TCID50評估豬瘟和偽狂犬病疫苗毒效價的衰減情況，另外在此基礎上選擇一普通規(guī)?；B(yǎng)豬場的商品豬群，將口蹄疫、豬瘟、偽狂犬病疫苗按照不同組合進行了免疫接種試驗，通過抗體檢測以驗證疫苗免疫效果。

1 材料與方法

1.1 試驗豬場

江蘇省南通市某規(guī)?；i場，經(jīng)產(chǎn)母豬 300頭，自繁自養(yǎng)，封閉式管理，豬群總體健康狀況良好。正常免疫豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病等疫苗，各項生產(chǎn)成績和技術(shù)指標正常。供試豬為該場母豬所產(chǎn)的健康仔豬，每頭試驗仔豬打耳標，做好標記。

1.2 疫苗

豬口蹄疫OA二價滅活疫苗（Re-O/MAY98/JSCZ/2013株 +Re-A/WH/09株），批號為18392270，由金宇保靈生物藥品有限公司生產(chǎn)；豬偽狂犬病耐熱保護劑活疫苗（C株），批號為19225026，由揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司生產(chǎn)；豬瘟活疫苗（傳代細胞源），由遼寧益康生物股份有限公司生產(chǎn)，批號為19335032。

1.3 檢測試劑及儀器

FMD-Ab 檢測試劑盒、PRVgEAb 檢測試劑盒均為內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司診斷試劑盒；PRVgB-Ab 檢測試劑盒為荷蘭百測（BioChek）診斷試劑盒，操作方法及結(jié)果判定標準均按照各試劑盒說明書進行。豬瘟野毒與兔化弱毒疫苗株實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，偽狂犬病野毒與gE基因缺失株實時熒光PCR檢測試劑盒，偽狂犬病病毒（gB基因）實時熒光PCR檢測試劑盒購自國測生物，操作方法及結(jié)果判定標準均按照各試劑盒說明書進行。

1.4 疫苗混合液準備

分別取 1 瓶50頭份豬口蹄疫OA二價滅活疫苗、 5 瓶10頭份豬偽狂犬活疫苗，5瓶10頭份豬瘟疫苗，室溫回溫2小時處理后，以口蹄疫疫苗為稀釋液，稀釋偽狂犬病和豬瘟疫苗，將稀釋好的組合疫苗混合液注回到口蹄疫疫苗瓶中，上下顛倒幾次充分混勻后觀察是否發(fā)生分層、不溶等肉眼可見性狀變化。

1.5 疫苗混合液黏度檢測

分別檢測混合前口蹄疫疫苗單品及口蹄疫疫苗稀釋偽狂犬病和豬瘟活疫苗之后混合液的黏度變化。

1.6 q-PCR檢測

口蹄疫疫苗稀釋豬偽狂犬病和豬瘟活疫苗制成混合液后，用連續(xù)注射器將疫苗分50次，2 mL/次，注射到離心管中，模擬疫苗注射到豬只體內(nèi)效果，用q-PCR的方法分別檢測每一離心管中豬瘟和豬偽狂犬病疫苗核酸的相對含量（Cq值）。

1.7 測定豬偽狂犬病疫苗病毒效價（TCID50）

試驗組為口蹄疫疫苗稀釋豬偽狂犬病凍干活疫苗，破乳分層后取水相備用，對照組用MEM無血清培養(yǎng)基稀釋豬偽狂犬病凍干活疫苗備用。ST 細胞培養(yǎng)至單層后，棄去細胞液；將準備好的疫苗毒樣品用DMEM無血清培養(yǎng)基按照10倍稀釋度連續(xù)倍比稀釋到10-9，將不同稀釋度的毒液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每個濃度做8個重復孔，每孔100 uL，吸附 1 h后，加入維持液；培養(yǎng) 96 h 后，觀察 CPE，記錄每個稀釋度的 CPE 數(shù)量，按照 Reed - muench 方法計算 TCID50。

1.8 測定豬瘟疫苗病毒效價

試驗組為口蹄疫疫苗稀釋豬瘟凍干活疫苗，破乳分層后取水相備用，對照組用MEM無血清培養(yǎng)基稀釋豬瘟凍干活疫苗備用。用實驗室自行建立的IFA方法檢測兩組稀釋后的豬瘟疫苗抗原含量。

1.9 臨床疫苗免疫試驗分組

選擇日齡相近的保育豬進行試驗，試驗分試驗組與對照組進行，兩組仔豬出生時均用豬偽狂犬病疫苗滴鼻1頭份，4周齡免疫豬瘟疫苗1頭份。試驗組7周齡用口蹄疫疫苗作為稀釋液，稀釋豬偽狂犬病和豬瘟活疫苗，混合液肌肉注射2 mL/頭（含口蹄疫疫苗1頭份、豬瘟疫苗1頭份、豬偽狂犬病疫苗1頭份），12周齡用口蹄疫疫苗作為稀釋液，稀釋豬偽狂犬病活疫苗，混合液肌肉注射2 mL/頭（含口蹄疫疫苗1頭份、豬偽狂犬病疫苗1頭份）。對照組7周齡，豬偽狂犬病和豬瘟活疫苗，分別用專用稀釋液稀釋再與口蹄疫滅活苗，頸部肌肉分邊注射，12周齡豬偽狂犬病活疫苗，用專用稀釋液稀釋與口蹄疫滅活苗，頸部肌肉分邊注射，口蹄疫疫苗2 mL/頭，豬偽狂犬病活疫苗1頭份，豬瘟活疫苗1頭份。試驗組免疫100頭仔豬，對照組免疫90頭仔豬。

1.10 采血及抗體檢測

兩組分別在4周齡、7周齡、12周齡、17周齡采血，每組10頭，分離血清，檢測FMD-Ab、PRVgEAb和PRVgB-Ab、CSF-Ab抗體水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗混合液性狀觀察

口蹄疫疫苗稀釋豬偽狂犬病和豬瘟凍干疫苗能很好地溶解，瓶底沒有沉淀和不溶成分，疫苗混合液樣品混合搖勻后未發(fā)生分層、沉淀等肉眼可見性狀變化。

2.2 黏度檢測結(jié)果

對比口蹄疫滅活苗單苗組與組合稀釋組按照離心處理，劑型無變化，黏度變化很小(見表2)，對通針性沒有影響。

2.3 qPCR檢測豬瘟和偽狂犬病核酸相對含量

對隨機選取的28份離心管中的樣品，提取核酸檢測豬瘟疫苗毒核酸Cq值，每份樣品做一個重復，檢測結(jié)果如表3，其中“Cq平均值”的算術(shù)平均值為26.46，CV%值為2.12，有很好的均勻度。

對隨機選取的28份離心管中的樣品，提取核酸檢測偽狂犬疫苗毒核酸Cq值，每份樣品做一個重復，檢測結(jié)果如表4，其中“Cq平均值”的算術(shù)平均值為19.27，CV%值為6.14，有很好的均勻度。

表1 各組免疫程序設計

表2 各組黏度檢測

2.4 豬偽狂犬病疫苗病毒效價

對比發(fā)現(xiàn)用口蹄疫疫苗稀釋與用MEM溶液稀釋相比，豬偽狂犬病活疫苗TCID50沒有差異（見表5）。

2.5 豬瘟疫苗病毒效價

對比發(fā)現(xiàn)用口蹄疫疫苗稀釋與用MEM溶液稀釋相比，豬瘟活疫苗TCID50沒有明顯差異（見表6）。

2.6 臨床疫苗免疫試驗各試驗組抗體檢測結(jié)果

兩 組 免 疫 后 4 h、8 h、24 h，豬只均未出現(xiàn)嘔吐、精神沉郁、不食等副反應。液相阻斷ELISA檢測結(jié)果表明無論是組合免疫組還是對照免疫組在二次免疫后五周檢測，口蹄疫O型抗體和A型抗體100%均達到＞1：128，符合農(nóng)業(yè)部＞1：64比例在70%以上的要求（見表7）。同時此次試驗也表明此口蹄疫滅活疫苗稀釋豬偽狂犬病活疫苗不影響口蹄疫疫苗的免疫效果。

根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，免疫前后gE抗體均為陰性，表明該場本批次商品豬未受到偽狂犬病毒的感染，gB抗體為免疫豬偽狂犬病活疫苗產(chǎn)生，試驗組（組合免疫組）兩次免疫后，gB抗體不低于對照組分開免疫的效果。對照組首免時母源抗體偏高可能對疫苗會有干擾（見表8）。

根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，豬瘟免疫前母源抗體偏高，造成了首免后抗體的下降，但是二免后抗體迅速上升，12周齡后兩組均達到100%合格率，試驗組（組合免疫組）兩次免疫后，豬瘟抗體與對照組（分開免疫組）無顯著差異（見表9）。

3 討論

口蹄疫為我國一類傳染病，原農(nóng)業(yè)部制定《國家口蹄疫防治計劃（2012-2020）》，提出堅持預防為主，分型控制，大力推進免疫預防，疫情監(jiān)測等措施[1]?！秶邑i瘟防治指導意見（2017—2020 年）》，要求各地繼續(xù)對生豬實施豬瘟全面免疫，進一步落實各項綜合防控措施，有效控制、逐步消滅豬瘟[2-3]。偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一種重要傳染病，曾被認為是危害僅次于口蹄疫和豬瘟的主要傳染病之一[4]，2011年起，我國多地區(qū)豬場發(fā)生變異株偽狂犬病毒的流行[5-6]，2018年對全國358個規(guī)模豬場調(diào)查發(fā)現(xiàn)規(guī)模豬場偽狂犬病陽性率達72.63%[7]，高質(zhì)量疫苗免疫對該病的控制效果確實，尤其是豬偽狂犬病耐熱保護劑活疫苗（C株），有望成為凈化該病的重要措施[8-9]。自2018年非洲豬瘟傳入我國以來，對國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成重創(chuàng)，所有生存下來的養(yǎng)豬企業(yè)，無一不投入巨大精力和資金用于提高各項生物安全措施，然而在減少一切與豬只不必要的接觸的意識支配下，一些必要的免疫操作也被省去，從而造成之前得到較好控制的部分傳染病有抬頭趨勢。

表3 混合疫苗豬瘟核酸相對含量檢測

表4 混合疫苗偽狂犬病核酸含量檢測

表5 各組偽狂犬病抗原效價

表6 各組豬瘟抗原效價

表7 各組免疫前后口蹄疫抗體變化 %

表8 各組免疫前后偽狂犬病抗體變化 %

表9 各組免疫前后豬瘟抗體變化

口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病三種疫苗的混合操作，能很大限度地減少疫苗免疫次數(shù)，降低勞動強度，減少豬只的刺激，減少可能的因注射和接觸帶來的疫情傳播風險。豬口蹄疫OA二價滅活疫苗（Re-O/MAY98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）采用進口206佐劑，為水包油包水劑型， pH控制在7.4~7.6，成品疫苗不含滅活劑BEI，實驗室檢測與MEM相比溶解豬偽狂犬病和豬瘟凍干活疫苗，其抗原含量衰減情況無差異。

根據(jù)大數(shù)據(jù)檢測，免疫口蹄疫和豬偽狂犬病高效疫苗的豬群口蹄疫和偽狂犬病母源抗體衰減情況類似[9-10]，首免時間均可以放在8~12周齡，正好與豬瘟二免在同一時間。規(guī)模豬場可以考慮先在4~5周單免豬瘟，8~9周進行口蹄疫、偽狂犬病和豬瘟的混合免疫，12~13周進行口蹄疫和偽狂犬病的混合免疫。由于母源抗體的差異，不同豬場為了獲得最佳的免疫效果，需要在使用前進行抗體檢測，掌握適合本場的免疫程序，同時混合免疫時應注意疫苗混合過程中無菌操作。目前臨床統(tǒng)計了部分用戶的使用數(shù)據(jù)，截止目前江蘇、浙江、湖南、廣西、湖北、四川、云南、遼寧、陜西等省組合免疫共43 206頭，產(chǎn)生應激48頭，比例0.11%，臨床混合易操作，免疫效果良好，不良反應少。