潘紅梅 ,彭 剛 ,吳 玲 ,肖杰秋 ,徐 榮
(1.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460;2.重慶市武隆區(qū)畜牧發(fā)展中心,重慶 408500;3.云南省綏江縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,云南 綏江 657700)
2009 年起,國家對購買良種豬精液給予補(bǔ)貼,在全國范圍內(nèi)推廣豬人工授精技術(shù),種豬常溫精液人工授精在我國全面普及。具有一定規(guī)模和較強(qiáng)經(jīng)濟(jì)實(shí)力的社會(huì)化公豬站在全國各地建立起來,逐漸形成一個(gè)完備的全國種豬常溫精液供精網(wǎng)絡(luò)體系,積極推動(dòng)了全國豬遺傳改良計(jì)劃的全面實(shí)施。各大種豬場間通過優(yōu)質(zhì)種公豬精液的交流來建立和增強(qiáng)場間遺傳聯(lián)系和跨群聯(lián)系。但種豬常溫精液保存時(shí)間短,保存條件和運(yùn)輸要求高等特點(diǎn)限制了其在遠(yuǎn)距離交流中的作用,而豬冷凍精液則能有效克服這些限制。冷凍精液能最大限度地存留頂級公豬的遺傳材料,為檢測人員提供足夠的時(shí)間檢測精液中可能攜帶的各種病原,有效地提高了精液交流中的生物安全保障。還可以在完成供精種公豬的后裔測定后,再確定是否擴(kuò)大該公豬精液的配種母豬數(shù),以獲得更大的遺傳進(jìn)展。
但豬精子對“冷休克”敏感,使得冷凍和解凍過程中的所有的操作環(huán)節(jié)都會(huì)對精子造成損傷,很難保證精子解凍后質(zhì)量的穩(wěn)定性,以致豬冷凍精液在商業(yè)化的道路上進(jìn)展緩慢。
豬的精液冷凍保存研究始于20 世紀(jì)50年代,1966年King等[1]將制作牛冷凍精液的成功方法用來冷凍豬的精液,精子解凍后活力為20%~50%,但解凍精子在37 ℃下存活不到5 h。同時(shí),King將冷凍精液對19頭經(jīng)產(chǎn)母豬和5頭初產(chǎn)母豬進(jìn)行輸配,全部返情。直至1970年,Polge 等[2]才通過手術(shù)法將豬的冷凍精液直接注入輸卵管,首次獲得冷凍精液配種生產(chǎn)的仔豬。1年后,Crabo and Einarrsson(1971),Graham(1971)及 Pursel and Johnson(1971) 分別報(bào)道通過豬子宮頸人工授精的方法,給母豬輸配冷凍精液可令母豬受精[3]。從此,各國科研人員在豬精液冷凍技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域展開全面研究。
全世界研究者們將各自在豬精液的冷凍保存機(jī)理、方法、技術(shù)關(guān)鍵環(huán)節(jié)、冷凍保護(hù)劑等方面的研究進(jìn)展在豬精液冷凍保存國際會(huì)議(International Conference on Boar Semen Preservation)上進(jìn)行交流,至2019年,該國際會(huì)議已經(jīng)召開了 9 次,每一次會(huì)議的召開,都積極地推動(dòng)了豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。
我國對豬精液冷凍技術(shù)的研究起步較晚,但發(fā)展迅速,成績顯著。從1973年開始在廣東、廣西等省、區(qū)相繼開始進(jìn)行公豬精液冷凍實(shí)驗(yàn)。1975年5月12日,廣西畜牧所成功獲得我國首例凍精配種生產(chǎn)的仔豬,窩產(chǎn)13頭,全部成活[4]。截至1976年底廣西、廣東、陜西等多地已對4 000多頭次母豬進(jìn)行凍精輸配,情期受胎率一般在30%~40 %,個(gè)別單位達(dá)到70 %[5]。1977年成立全國豬精液冷凍技術(shù)研究協(xié)作組,對冷凍精液的制作、稀釋液篩選、凍精解凍程序、凍精質(zhì)量評價(jià)及凍精配種等問題開展研究。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),1975-1983年全國各地對21 859頭母豬進(jìn)行凍精輸配,平均情期受胎率為56.25%,窩產(chǎn)仔平均為8.18頭[6],其中,杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的凍精受胎率高達(dá)82.38%,配種產(chǎn)仔率高達(dá)72.95%[7]。
據(jù)張繼慈的翻譯文章中報(bào)道[8],日本6年(1982-1987年)來共使用顆粒凍精輸配母豬4 008頭,受胎率平均為39.6%,到1987年受胎率平均為49.4%,共產(chǎn)仔1 437窩,平均窩產(chǎn)仔數(shù)為8.0頭。許懷讓的翻譯文章中提到[9],在理想的實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)農(nóng)場條件下,凍精配種的產(chǎn)仔率可達(dá)60 %。在良好環(huán)境下,平均產(chǎn)仔率為55%,在典型商業(yè)性豬場中產(chǎn)仔率可能低于50 %,而用鮮精(或稀釋鮮精)進(jìn)行人工授精,可獲得80%的產(chǎn)仔率。由此可見,我國在豬精液冷凍保存研究的早期,受胎率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過日本,在一定程度上與歐美相似,甚至略高于歐美。
我國早期豬精液冷凍技術(shù)研究的主要特點(diǎn)是以領(lǐng)導(dǎo)、工人、技術(shù)人員相結(jié)合,大搞群眾運(yùn)動(dòng)。當(dāng)時(shí)我國物質(zhì)資源相當(dāng)匱乏,不但缺少完成實(shí)驗(yàn)研究所需的必要儀器設(shè)備,連凍精配種所需的母豬都是極稀少的。在如此艱苦的條件下,能結(jié)集全國各地如此多的力量,在短期內(nèi)完成如此大規(guī)模的凍精輸配實(shí)驗(yàn),取得舉世矚目的成績,與政府的支持和相關(guān)單位的積極參與和全力投入是分不開的。
由圖1可知,我國在20世紀(jì)90年代,對豬精液冷凍保存的研究有一段相對停滯期,這段時(shí)間,僅有少數(shù)幾個(gè)研究者在持續(xù)開展豬冷凍精液的研究。從2003年以后才重新掀起豬冷凍精液的研究熱,至2010年,相關(guān)的中文文章發(fā)表達(dá)到一個(gè)高潮,一年內(nèi)發(fā)表文章超過30篇。筆者分析有以下原因:
隨著改革開放在我國深入展開,在市場經(jīng)濟(jì)指導(dǎo)下的養(yǎng)豬行業(yè)發(fā)生了天翻地覆的變化。母豬的快繁高產(chǎn)技術(shù)成為繁殖學(xué)科在養(yǎng)豬上的重點(diǎn)攻關(guān)技術(shù)??旆备弋a(chǎn)技術(shù)體系中的重要成員種豬常溫精液的人工授精技術(shù)迎來發(fā)展的春天。國家實(shí)施生豬良種補(bǔ)貼政策,直接補(bǔ)貼種豬常溫精液,全面推進(jìn)我國種豬常溫精液人工授精技術(shù)的普及,人工授精技術(shù)水平全面提高。
然而,隨著全國豬聯(lián)合育種工作的開展,常溫精液的局限性也顯露出來。如場間精液交流的生物安全性、遠(yuǎn)程精液運(yùn)輸?shù)臅r(shí)效性、頂級種公豬遺傳物質(zhì)的最大限度的利用、地方豬遺傳資源的靜態(tài)保存、夏季常溫精液質(zhì)量差等一系列常溫精液不能解決的問題再次呈現(xiàn)在從業(yè)者面前。從而,大家再次將目光轉(zhuǎn)移至種豬精液冷凍上來。
當(dāng)我們都在關(guān)注種豬常溫精液的人工授精技術(shù)時(shí),歐美國家并未停止冷凍精液的研究。他們研究了用塑料細(xì)管作為冷凍精液的載體,同時(shí)開發(fā)了程序化冷凍設(shè)備及相應(yīng)的計(jì)算機(jī)輔助精液質(zhì)量檢測系統(tǒng)。借助先進(jìn)的精液冷凍設(shè)備,美國和加拿大向世界各國出售其優(yōu)質(zhì)種豬冷凍精液。至此,我國開始從國外引進(jìn)生產(chǎn)冷凍精液的設(shè)備、技術(shù)及種豬冷凍精液,開啟了邊研究邊引進(jìn)的豬冷凍精液發(fā)展進(jìn)程。隨著冷凍精液專用設(shè)備的研發(fā)和配套的豬人工授精技術(shù)的進(jìn)步,豬精液冷凍研究與應(yīng)用在我國發(fā)展迅速。近年來,國內(nèi)百鈞達(dá)、北京田園奧瑞等公司相繼研發(fā)了豬精液冷凍保存技術(shù),自主開發(fā)冷凍保護(hù)劑和精液冷凍設(shè)備,并在全國范圍內(nèi)開始豬冷凍精液的商業(yè)化生產(chǎn)、銷售[10]。廣東溫氏、上海祥欣等國內(nèi)知名育種企業(yè)已相繼建立豬冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)平臺,能為國內(nèi)外客戶提供優(yōu)質(zhì)遺傳資源,并為客戶提供配套的人工授精技術(shù)指導(dǎo)。表1中列出近20年我國部分豬場種豬冷凍精液應(yīng)用情況。
表1 近20年我國部分豬場種豬冷凍精液應(yīng)用情況表
由表1可知,近20年來,我國豬冷凍精液技術(shù)發(fā)展迅速,進(jìn)展喜人。尤其是商業(yè)化的應(yīng)用開發(fā)團(tuán)隊(duì)百均達(dá)、田園奧瑞的掘起,加速種豬冷凍精液的質(zhì)量提升,不論在配種受胎率還是窩產(chǎn)活仔數(shù)上都相比早期的顆粒凍精時(shí)代有了質(zhì)的飛躍。同時(shí),對比國產(chǎn)豬凍精和國外引進(jìn)豬凍精的配種產(chǎn)仔成績不難發(fā)現(xiàn),國產(chǎn)凍精配種的的受胎率、配種分娩率及窩產(chǎn)活仔數(shù)均已遠(yuǎn)超國外引進(jìn)凍精。尤其是海南羅牛山的凍精,竟達(dá)到100%的配種分娩率,而重慶農(nóng)投2016年從英國引進(jìn)的凍精配種分娩率僅達(dá)11.11%,且窩產(chǎn)活仔數(shù)只有4頭。筆者所在的團(tuán)隊(duì)也對百均達(dá)的凍精和加拿大的凍精配種結(jié)果作了比較,配種結(jié)果表明,百均達(dá)凍精配種分娩率為57.81%,窩產(chǎn)活仔數(shù)8.3頭;加拿大引進(jìn)凍精配種分娩率40.54%,窩產(chǎn)活仔數(shù)8.53頭(數(shù)據(jù)未發(fā)表),國產(chǎn)凍精配種成績優(yōu)于加拿大引進(jìn)凍精。
盡管目前我國豬冷凍精液質(zhì)量已提高到世界先進(jìn)水平,商業(yè)化應(yīng)用逐漸擴(kuò)大,但豬冷凍精液要完全實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用仍有很長的路要走。
精子的冷凍損傷包括物理損傷、化學(xué)損傷和自身氧化損傷3類,這些損傷貫穿整個(gè)冷凍-解凍過程。目前,在冷凍程序上,通過程序降溫儀可有效控制降溫速度和解凍速度,在一定程度上可有效降低物理冰晶對精子的損傷;而冷凍保護(hù)劑的不斷改進(jìn),冷凍過程中的精子受到的化學(xué)性損傷也在逐漸改善。但是,在冷凍降溫過程中,精子細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(ROS),過量的ROS在細(xì)胞內(nèi)堆積,引發(fā)精子膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng),產(chǎn)生大量脂類過氧化物,導(dǎo)致精子質(zhì)膜破損,DNA鏈斷裂,核染色質(zhì)損傷,精子呼吸被抑制,蛋白質(zhì)氧化損傷等[22]。由于豬精子膜上的不飽和脂類含量較其他物種高,更容易發(fā)生氧化反應(yīng),導(dǎo)致豬精子冷凍質(zhì)量低下,因此氧化性損傷對豬精液冷凍影響更大。
近年來,蛋白組學(xué)研究已發(fā)展成生命科學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù),蛋白表達(dá)的檢測、蛋白間相互作用的檢測等技術(shù)被廣泛應(yīng)用。將蛋白組學(xué)的研究方法用于精子損傷機(jī)理,尤其是冷凍過程中大分子蛋白質(zhì)損傷的研究,有望進(jìn)一步揭示精子冷凍損傷的機(jī)理及提高精子的冷凍保存效率,加速推動(dòng)豬精液冷凍保存技術(shù)進(jìn)展。
豬精液冷凍工藝流程中基本上有 11 個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)涉及到溫度條件:原精液活力檢測→原精液稀釋、自然降至室溫→轉(zhuǎn)入恒溫箱(17 ℃)中恒溫保存→17℃ 環(huán)境條件離心→棄上清液、等溫添加無甘油稀釋液→置低溫柜(3~5 ℃)降溫、平衡→平衡溫度下添加含甘油稀釋液→平衡溫度下封裝細(xì)管精液→置入冷凍程序儀器進(jìn)行精液冷凍→細(xì)管凍精分裝保存→細(xì)管凍精解凍→解凍后精子活率質(zhì)量檢測分析。在這個(gè)工藝流程中涉及的溫控設(shè)備有空調(diào)、顯微鏡恒溫臺、17℃恒溫箱、溫控離心機(jī)、4℃低溫操作柜、程序冷凍儀、細(xì)管分裝儀、恒溫水浴鍋等。配齊一套完整的設(shè)備,需要配備專門的實(shí)驗(yàn)室,且設(shè)備采購費(fèi)用高昂,一般養(yǎng)豬企業(yè)難以實(shí)現(xiàn)。少數(shù)企業(yè)或單位具備冷凍精液的制作條件,也限制了豬冷凍精液在實(shí)際生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。
徐章龍[7]在1980年對23頭公豬精液耐凍性測試中,發(fā)現(xiàn)豬只個(gè)體間精液耐凍性差異很大,不同個(gè)體的凍精受胎率也有差異。他認(rèn)為有必要測試公豬原精液的各項(xiàng)指標(biāo)和耐凍性,而且解凍后的活力并不表示受胎率,要想提高豬冷凍精液的質(zhì)量和受胎率,需要對供精公豬精子的耐凍性和受胎率進(jìn)行檢測。但時(shí)至今日,40年時(shí)間過去,關(guān)于供精公豬精子耐凍性檢測和精子受胎能力檢測的問題依然沒有解決。目前仍采用大量的冷凍實(shí)驗(yàn)來篩選耐凍精子的供應(yīng)體,而凍精受胎能力則需要對其多次配種結(jié)果分析才能獲得。這些方法工作量大,耗時(shí)長,不適應(yīng)商業(yè)化生產(chǎn)要求。希望在以后的研究中能找到相關(guān)的差異基因,研制出有效檢測試劑盒,以提高凍精公豬的選擇能力,擴(kuò)大冷凍精液的生產(chǎn)量。
據(jù)陳獻(xiàn)欣[17]報(bào)道,廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司于2016年分別在傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式和全程空氣過濾模式的兩種豬場,開展冷凍精液配種試驗(yàn),將加拿大引進(jìn)的精液在傳統(tǒng)場輸配母豬51頭,配種產(chǎn)仔率49.02%,窩產(chǎn)活仔數(shù)7.48頭;在全程空氣過濾場輸配母豬99頭,配種產(chǎn)仔率69.70%,窩產(chǎn)活仔數(shù)7.81頭。上海祥欣[18]采用百均達(dá)的凍精在國家生豬核心育種場配種,配種分娩率高過80.87%,窩產(chǎn)活仔數(shù)高達(dá)9.75頭;而筆者采用百均達(dá)凍精在小規(guī)模商品豬養(yǎng)殖場配種,配種分娩率為57.81%,窩產(chǎn)活仔數(shù)8.3頭(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。由此可見,冷凍精液配種產(chǎn)仔成績與豬場的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件密切相關(guān)。對大多數(shù)硬件條件不過硬,飼養(yǎng)管理水平不夠高的豬場,冷凍精液要達(dá)到普通常溫精液的生產(chǎn)成績,還有很長的路要走。
從幾十年凍精配種經(jīng)驗(yàn)得知,采用冷凍精液配種對母豬的胎次和健康狀況要求都很高。一般要選擇3~5胎的經(jīng)產(chǎn)母豬,且要求這些母豬在斷奶后4~6 d能正常發(fā)情。這樣的母豬凍配后才能獲得較高的受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)。但在實(shí)際生產(chǎn)中,這類母豬在普通條件的豬場是提高生產(chǎn)成績的中堅(jiān)力量,通常采用常溫精液配種,它們的受胎率能達(dá)到90%以上,窩產(chǎn)活仔數(shù)超過12頭。如此大的差距,是普通生產(chǎn)場所不能接受的。因此,冷凍精液在全國范圍內(nèi)大面積推廣,還很困難。
雖然商業(yè)售賣的豬冷凍精液解凍和稀釋后仍具有較高的活力,但精子在冷凍-解凍過程中均遭受到不同程度的損傷,導(dǎo)致它在母豬生殖道的獲能存活時(shí)間大大縮短,致使受胎率、配種產(chǎn)仔率及產(chǎn)活仔數(shù)等繁殖指標(biāo)明顯低于液態(tài)保存精液。
做好母豬的發(fā)情鑒定,準(zhǔn)確判斷母豬的排卵時(shí)間,把握好準(zhǔn)確的輸精時(shí)間至關(guān)重要。對配種員的發(fā)情鑒定技術(shù)和深部輸精技術(shù)要求更高。有專家提出冷凍精液的理想受精時(shí)間往往在母豬排卵前的4~6 h范圍內(nèi),使用凍精配種的豬場應(yīng)把母豬的發(fā)情鑒定次數(shù)由原來的2次/d增加到 3次/d(即早上5:00,中午13:00,晚上21:00),以提高凍配母豬的受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)。
豬冷凍精液作為一種特殊的生物產(chǎn)品,其質(zhì)量影響因素諸多,質(zhì)量極易出現(xiàn)波動(dòng),精液冷凍過程中任何一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)上的失誤可導(dǎo)致全過程的失敗。即使來自同一頭供體公豬的精液由同一個(gè)人凍存,不同采精批次,不同的人解凍操作,都會(huì)出現(xiàn)差異性的結(jié)果。面對這種情況,在精液解凍后,輸配前質(zhì)量評定及輸配精液數(shù)量的把握至關(guān)重要。前人的研究結(jié)果表明,凍精輸精時(shí),有效精子數(shù)量越多,配種產(chǎn)仔率和受胎率越高。
2017年河北省頒發(fā)《豬冷凍精液》(DB13/T 2633-2017)的地方標(biāo)準(zhǔn),這是我國第1個(gè)關(guān)于豬冷凍精液產(chǎn)品要求的標(biāo)準(zhǔn)。目前,全國多個(gè)地區(qū)或單位均在開展豬冷凍精液標(biāo)準(zhǔn)的起草和研究。但與精子運(yùn)動(dòng)能力和受精能力密切相關(guān)的質(zhì)膜、頂體、線粒體膜等直接關(guān)系精子受精能力的質(zhì)量指標(biāo)至今沒有好的檢測方法。我們還需要繼續(xù)加強(qiáng)對冷凍精子質(zhì)量評價(jià)方法的研究,并在相關(guān)檢測單位和檢測人員中進(jìn)行試用和調(diào)研。制訂出操作簡便,重復(fù)性好的評價(jià)方法,能客觀評定凍精質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn),是我們在實(shí)際生產(chǎn)中推廣凍精,有效監(jiān)督的前提。
隨著豬人工授精技術(shù)的發(fā)展,公母豬配種比例從1∶20的本交,發(fā)展到1∶200或1∶300的普通常溫精液輸精,再到1∶400的低劑量輸精技術(shù),在減少種公豬飼養(yǎng)數(shù)量的同時(shí),更大程度地發(fā)揮優(yōu)質(zhì)公豬的遺傳潛力。而冷凍精液配合深部輸精技術(shù)可以將優(yōu)質(zhì)公豬的配種比例增加到1∶1 000,可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的最大化利用。未來我國生豬改良計(jì)劃的實(shí)現(xiàn),需要優(yōu)質(zhì)種公豬的冷凍精液參與,而優(yōu)質(zhì)冷凍精液的應(yīng)用和推廣需要全國上下同心,共同努力才能實(shí)現(xiàn)。
在政府層面上,我們需要政府的資金和政策的支持。我國在20世紀(jì)70年代啟動(dòng)的豬冷凍精液研究在各級政府的大力支持下,全國幾十個(gè)科研院所聯(lián)合攻關(guān),在短短十多年的時(shí)間里,取得舉世矚目的重大成績。但自此以后,豬的冷凍精液研究進(jìn)展總是斷斷續(xù)續(xù),上到國家、下到基層科研院所,極少有相關(guān)的項(xiàng)目支持,基本都是感興趣的學(xué)者和企業(yè)在小范圍內(nèi)獨(dú)自研究。如果國家能給予持續(xù)的政策和經(jīng)費(fèi)的支持,豬的精液冷凍保存技術(shù)應(yīng)該會(huì)有一個(gè)新的提升。
科研院所方面,需要加大人力投入,從冷凍機(jī)理、冷凍保護(hù)劑的開發(fā)、冷凍技術(shù)、程序設(shè)計(jì)等方面對現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)梳理,提出其中的難點(diǎn)、可攻克點(diǎn),有針對性地逐項(xiàng)研究攻關(guān),形成應(yīng)用于生產(chǎn)的技術(shù)規(guī)范,努力提高豬冷凍精液冷凍-解凍后的配種成績。
養(yǎng)豬企業(yè)方面,配合科研院所的新技術(shù)應(yīng)用研究與推廣,提供種公豬精液材料和種豬選育資料,力爭將遺傳性能測定后的優(yōu)秀公豬精液用于制作凍精,最大限度發(fā)揮優(yōu)質(zhì)公豬的遺傳潛力。同時(shí),借助國家生豬交易平臺,將冷凍精液的可溯源產(chǎn)品信息發(fā)布出來,在平臺上公開。
總之,我們目前在豬冷凍精液方面的產(chǎn)學(xué)研幾條線各自為政,相互間的關(guān)聯(lián)嚴(yán)重脫節(jié)。希望政府能給予支持,倡導(dǎo)相關(guān)行業(yè)聯(lián)動(dòng)起來,共同促進(jìn)種豬冷凍精液的質(zhì)量提升和標(biāo)準(zhǔn)化、商業(yè)化應(yīng)用。