崔茂盛（編譯）

（天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

1 引言

非洲豬瘟病毒（ASFV）是病毒家族中唯一非常獨(dú)特的成員（Alonso et al.， 2018）。在家豬和野豬（Susscrofa）中，ASFV是高致病性的，能夠引起出血性及高致命性的ASF疾病，而且ASFV可在不同物種之間流行和暴發(fā)。近年來(lái)，ASF迅速蔓延，對(duì)全世界生豬產(chǎn)業(yè)造成巨大威脅（Cisek et al., 2016;Jurado et al., 2018; Kyyroet al., 2017;Nurmoja et al., 2017; Sanchez-Cordon et al., 2018; Vergneet al.,2017），可惜目前仍無(wú)安全有效的ASF疫苗可用。ASFV的毒力、免疫原性，更重要的是病毒表型和抗原多樣性等一直困擾著ASF疫苗研發(fā)進(jìn)程（Arias et al., 2017; Revilla et al., 2018; Rock, 2017）。 認(rèn) 識(shí)ASFV具有多樣性的關(guān)鍵是ASFV基因和基因組變異。ASFV的衣殼蛋白（p72）基因（B646L）是最早用于大規(guī)模評(píng)估ASFV遺傳多樣性的遺傳靶點(diǎn)之一（Bastos et al., 2003）。在B646L基因部分測(cè)序的基礎(chǔ)上，Bastos和同事鑒定了22個(gè)ASF基因型，建立了標(biāo)準(zhǔn)的ASFV基因型標(biāo)記，但p72基因分型有時(shí)并不能夠提供足夠的分型分辨率來(lái)區(qū)分不同生物表型的病毒（Malogolovkin et al., 2015a）。 通 過(guò)對(duì)p54 （E183L）、p30 （CP205L）和B602L基因的研究，進(jìn)一步提高了ASFV基因型分辨率（Bastos et al.,2004; Lubisi et al., 2007,2005; Gallar do et al., 2009; Nix et al., 2006）。目前，全基因組測(cè)序技術(shù)可為ASFV生物學(xué)多樣性研究提供有力手段。文章主要綜述ASFV遺傳和抗原多樣性的研究成果，并提出闡明ASFV多樣性的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

2 ASF基因和基因組

目前已測(cè)序的ASFV基因組長(zhǎng)度不一，大小從170 101到193 886個(gè)堿基對(duì)。ASFV許多基因都是基于與痘病毒的同源性而命名（Dixon et al., 2013;Galindo and Alonso, 2017），并對(duì)與ASFV參考毒株ba71v及其他毒株的親緣關(guān)系進(jìn)行了深入的研究（Chapman et al., 2008; Rodríguez et al., 2015; Yá?ez et al., 1995）， 但到目前為止ASFV許多核心基因的功能仍然未知。該核心基因區(qū)域存在著可變基因和基因間區(qū)域（例如中心可變區(qū)，或CVR等）。比較基因組分析還確定了一系列分布在基因組核心區(qū)域內(nèi)外的基因，作為ASFV基因組中最可變的同源基因即CD2v/EP402R和c型凝集素/EP153R，可能是ASFV遺傳多樣性的來(lái)源（Chapman et al., 2011; de Villiers et al.,2010），與核心區(qū)域相比，位于末端的ASFV線性基因組區(qū)域在大小和基因含量上更具有差異性，被稱為左變區(qū)和右變區(qū)（LVR和RVR）。ASFV末端基因組區(qū)域主要由同源基因的多基因家族（MGF）控制。5個(gè)MGFs （MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505）根據(jù)其平均氨基酸長(zhǎng)度命名 （Almendral et al., 1990; Chapm an et al., 2008; Dixon et al., 2013; Gon zález et al., 1990; Pireset al., 1997; Yoz awa et al., 1994）。在功能基因組研究中，已經(jīng)證明了MGF360的毒力和功能，并指出MGF505可能是病毒毒力因子之一，為疫苗的設(shè)計(jì)研發(fā)提供了新的思路（O’Donnell et al.,2016, 2015; Reis et al., 2016）。

自東歐首次發(fā)現(xiàn)ASFV以來(lái)，登記的ASFV序列數(shù)量迅速增加。來(lái)自愛(ài)沙尼亞、波蘭、拉脫維亞、立陶宛的ASFV基因序列顯示，ASFV基因組高度穩(wěn)定，和親代ASFV/亞美尼亞2007毒株之間超過(guò)99%的同源性（FR682468）。然而，目前已在不同基因和基因間區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多個(gè)單核苷酸的變化，包括翻譯蛋白的移碼和終止區(qū)（Fracz yk et al., 2016; Gallardo et al., 2018a,2018b; mietankaet al., 2016）， 這 些微小變化的生物學(xué)意義需要被充分研究。有趣的是，雖然大多數(shù)毒株的ASFV基因組GC含量平均約為38%，但GC含量相對(duì)較低的區(qū)域位于LVR和RVR以及中心區(qū)域（圖1）。GC含量的減少可能在病毒進(jìn)化中發(fā)揮重要作用，也可能是GC堿基合成的生化成本較高的結(jié)果 （?marda et al., 2014）。

盡管對(duì)ASFV研究的歷史悠久，但可公開(kāi)獲得的ASFV全基因組序列數(shù)量有限。GenBank包含42個(gè)完整的ASFV基因組序列，其中只有33個(gè)屬于野毒毒株。為了更好地掌握該病毒基因組的可塑性、抗原多樣性和進(jìn)化特征，需要更多更完整的ASFV序列。在污水（Lohet al., 2009）和海洋環(huán)境（Ogata et al., 2009）中也發(fā)現(xiàn)了類似于ASFV序列，提示人們?nèi)衾煤昊蚪M技術(shù)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多類似 ASFV 序 列（Kuhn et al., 2019）。一般來(lái)說(shuō)，DNA病毒的突變率比RNA病毒低（Sanjuan et al., 2010）。利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)評(píng)估ASFV基因區(qū) 域（B646L, CP204 L和B602 L/CVR）基因的進(jìn)化率，B646L位點(diǎn)每年的進(jìn)化率可能為RNA病毒的6.9×10-4。對(duì)來(lái)自東非的ASFV分離株研究表明，B602L基因小規(guī)模串聯(lián)重復(fù)序列（TRSs）數(shù)量有所增加（Lubisi et al., 2007, 2005），同樣在歐亞流行的ASFV毒株中，如高加索、俄羅斯和歐洲ASFV分離株的研究中也發(fā)現(xiàn)了TRSs （Gallardo et al., 2014; Golleret al., 2015; Kolbaso v et al., 2018）。從2014年到2018年，歐洲和中國(guó)的ASFV分離株中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的突變（Bao et al., 2019;Cisek et al., 2016; Gallardo et al.,2018a,2018b; Garigliany et al., 2019; Ge et al.,2018; Smietanka et al.,2016; Zhou et al., 2018）。但這些小規(guī)模的核苷酸突變與ASFV表型之間的生物學(xué)意義和相關(guān)性仍不清楚。

與單核苷酸突變相比，基因含量的變化更容易解釋病毒表型的變化（Zaniet al.，2018）。 同 源 基 因的ASFV多基因家族（MGF）是最易變的遺傳組成部分，相對(duì)于基因組的其他部分，其基因含量發(fā)生了巨大的變化，且出現(xiàn)了基因復(fù)制、序列分化、基因缺失和重組等現(xiàn)象，這些都會(huì)對(duì)ASFV基因組的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很大的影響（De La Vega et al.,1990; Yá?ez et al., 1995）。 攜帶多個(gè)MGF拷貝的ASFV毒株具有更大的基因組（圖1），并通常與更強(qiáng)的毒性相關(guān)（Chapman et al.,2008; Krug et al., 2015; Rodríguez et al.,2015）。重組雖然是基因進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力（Barton, 2010），但其是否發(fā)生在ASFV毒株之間尚未有明確的證據(jù)。系統(tǒng)發(fā)育重構(gòu)的研究表明，ASFV重組事件經(jīng)常發(fā)生在MGF、E183L、B602L、EP153R 和EP402R（CD2v）等基因部位（Chap man et al., 2008; Michaud et al., 2013;N efedeva M. et al., unpublished）?？傊?，這些產(chǎn)生多樣性的進(jìn)化過(guò)程驅(qū)動(dòng)特定基因和編碼抗原的變化，這些研究結(jié)果可能會(huì)影響到疫苗接種策略或弱毒活疫苗的穩(wěn)定性。

3 血清型的抗原多樣性

Malmquist在1960年首先利用紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（HA）和紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)（HAI）評(píng)估不同ASFV分離株在體外血清學(xué)交叉反應(yīng)，鑒定出幾種ASFV抗原類型（Malmquist and Hay, 1960）。此 后，探討病毒抗原類型的決定成分成為研究的熱點(diǎn)。作為區(qū)分血清型特異性的有力工具，目前HAI已在俄羅斯聯(lián)邦病毒學(xué)和微生物學(xué)研究中心被廣泛使用，并建立了基于HAI的ASFV分類，以區(qū)分病毒抗原類型，確定了8個(gè)ASFV血清組并進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定。后來(lái)參考其他參數(shù)如血凝素密度（每個(gè)受感染細(xì)胞的紅細(xì)胞數(shù)），進(jìn)一步改進(jìn)了ASFV的 分 類（Makarov et al., 2016）?；贖AI分析的ASFV毒株篩選可用于開(kāi)發(fā)一種潛在的弱毒活疫 苗（Sereda et al., 1992; Sereda and Balyshev, 2011）。 其 實(shí)，Malmquist W.A早已發(fā)現(xiàn)HAI分類的意義，他使用HAI分析開(kāi)展了同源或異源性的ASFV分類。根據(jù)他的研究結(jié)果，感染后恢復(fù)期豬的血清可以抑制感染了同源ASFV的巨噬細(xì)胞中的HA。血凝吸附抑制的關(guān)鍵如圖2所示。幸運(yùn)的是，Rodriguez等 人 在1993年 發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)介導(dǎo)HA的病毒決定成分為ASFV編碼的細(xì)胞CD2同源物，即CD2v蛋白的EP402R基因（Rodríguez et al., 1993）。 后 來(lái)，ASFV c型凝集素樣蛋白（EP153R基因）被認(rèn)為是HA的輔助抗原（Galindo et al.,2000）。比較基因組研究已經(jīng)確定這些基因是ASFV分離毒株中最具多樣性的基因（Cha pman et al., 2008; deVilliers et al.,2010），超過(guò)80株ASFV毒株系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，CD2v/ c型凝集素基因型組與HAI血清學(xué)組相關(guān)，并顯示出CD2v/ c - electin與保護(hù)性免疫反應(yīng)之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性，該研究進(jìn)一步提出了尚未在血清學(xué)上確定特征的其他潛在血清組（Malogolovkin et al., 2015b）。 由 于ASFV CD2v/ c型凝集素蛋白在體內(nèi)具有特異性免疫保護(hù)和體外細(xì)胞免疫的特性，目前已與HAI 血清特異性關(guān)聯(lián)在一起，稱為血清型特異性ASFV抗原（Burmakina et al., 2019,2016; Malogolovkin et al.,2015b）。然而，CD2v和c型凝集素雖然在體內(nèi)對(duì)介導(dǎo)交叉保護(hù)反應(yīng)很重要，但在血清型特異性同源保護(hù)方面還不夠理想，暗示仍需鑒定更多的血清型特異性保護(hù)抗原。利用ASFV蛋白p30、p54和CD2v開(kāi)展的亞單位疫苗目前也只具有部分誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用，而且它們?cè)诖龠M(jìn)血清型特異性應(yīng)答方面的作用機(jī)制尚不清楚（Argilaguet et al., 2013; Barderas et al., 2001; Gómez-Puertas et al., 1998;Ruiz-Gonzalvo et al., 1996）。 利 用康復(fù)動(dòng)物抗體介導(dǎo)的HAI仍是目前研究ASFV疫苗抗原多樣性和保護(hù)潛力的重要手段。ASF康復(fù)豬血清的抑制潛力取決于血清活性、病毒劑量和同源或異源病毒類型等等（Rodríguez et al., 1994; Ruiz Gonzalvoet al., 1986a, 1986b）。但是，HAI分類和感染抑制試驗(yàn)的結(jié)果與“經(jīng)典”病毒中和試驗(yàn)的結(jié)果無(wú)關(guān)，這是一種影響體內(nèi)保護(hù)的新機(jī)制。

ASFV抗原多樣性是阻礙ASFV疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素。最近研究表明，ASFV弱毒活疫苗（缺乏CD2v的ASFV 毒株BA71） 對(duì)ASFV Georgia/2007具有對(duì)異源病毒交叉保護(hù)的潛力（Monteagudo et al., 2017）。 當(dāng) 前蛋白質(zhì)組學(xué)研究也已證實(shí)ASFV蛋白質(zhì)組同樣具有復(fù)雜性和靈活 性（Alejo et al., 2018）， 并發(fā)現(xiàn)了一些新的ASFV蛋白質(zhì)（Kessler et al.,2018）。ASFV蛋白質(zhì)組受到病毒和細(xì)胞本身嚴(yán)格的動(dòng)態(tài)調(diào)控，所以可能會(huì)因病毒株和宿主細(xì)胞的差異而發(fā)生重大變化。由此可見(jiàn)，ASFV基因組和/或抗原多樣性可以影響宿主反應(yīng)的多樣性，研究ASFV-宿主相互作用，有望將病毒基因型差異與表型多樣性進(jìn)一步相關(guān)聯(lián)。

抗ASFV免疫是一種類型的特異性免疫，可能與血清特異性抗體的水平相關(guān)。當(dāng)免疫動(dòng)物被異源性ASFV株感染后往往使ASF病情加重或?qū)е赂鼑?yán)重的其他疾病，因?yàn)橄惹绑w內(nèi)存在的免疫可能通過(guò)抗體依賴性增強(qiáng)（ADE）機(jī)制誘發(fā)更嚴(yán)重的發(fā)?。↘handia et al., 2018; Li et al., 2018）。雖然先前存在的ASFV免疫可能會(huì)影響T-細(xì)胞和抗體的反應(yīng)，但ADE主要是由中和能力較低的交叉反應(yīng)抗體引起的。盡管目前尚不清楚ADE機(jī)制是否發(fā)生在ASFV發(fā)病過(guò)程中，但在疫苗如何解決ASFV抗原多樣性問(wèn)題方面，ADE機(jī)制仍可能具有重要意義。

4 結(jié)論

自1921年首次報(bào)告非洲豬瘟以來(lái)已近一個(gè)世紀(jì)，作為病毒家族中的一種獨(dú)特病毒，ASFV對(duì)世界生豬養(yǎng)殖的威脅比以往任何時(shí)候都大。ASFV的多樣性和復(fù)雜性是阻礙疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素。開(kāi)展對(duì)歷史上的和不同的ASFV毒株基因測(cè)序分析，將有助于了解來(lái)自不同宿主的ASFV基因組之間的多樣性，有助于揭示ASFV進(jìn)化關(guān)系，有助于確定抗原和表型變異的決定基因。基于ASFV CD2v的紅細(xì)胞吸附和比較基因組學(xué)，為識(shí)別與病毒抗原表型和交叉保護(hù)免疫相關(guān)的遺傳特征提供了一種可靠的方法。而識(shí)別其他血清型特異性保護(hù)性抗原，可能是設(shè)計(jì)特異性和有效性ASF疫苗所必需的。