賀 燦 ，張 彬

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.湖南新五豐股份有限公司，湖南 長沙 410005）

非洲豬瘟（African Swine fever ,ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的家豬和野豬的一種高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)高熱、不食、皮膚和內(nèi)臟廣泛性出血，急性死亡率可達到100%，可造成嚴重的養(yǎng)殖損失。非洲豬瘟病毒在分類上是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟屬目前的唯一成員，是一種雙鏈DNA分子病毒，基因組大小170～190 kb，研究已知能編碼100種以上的蛋白質(zhì)。非洲豬瘟病毒在病豬的血液、糞便、口鼻液和病變組織器官中大量存在，環(huán)境中存在有機載體的情況下該病毒具有非常強的生存能力，凍肉冷庫中甚至可以存活好幾年。ASFV感染途徑和傳播方式眾多，最直接的傳播方式是健康的豬只身體直接接觸發(fā)病豬，而正常豬群飼喂受到ASFV污染的飼料和廚余垃圾等，或者通過消化道和呼吸道接觸血液、污染的運豬車輛等均能直接或間接感染該病。ASFV的可怕之處還在于防控與治療的難度非常大，目前世界上尚無上市的有效的非洲豬瘟疫苗產(chǎn)品，因此當前在該病流行國家主要依靠科學的實驗室診斷與完善生物安全防控體系來保證養(yǎng)豬生產(chǎn)安全。文章中采用TaqMan 探針實時熒光PCR技術(shù)，是一種快速、準確的非洲豬瘟病毒檢測方法，結(jié)合非洲豬瘟傳播感染途徑的特點，文章提出制定科學的診斷程序與防控措施來保證養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)安全。

1 非洲豬瘟診斷技術(shù)

1.1 科學診斷方法的建立

目前，非洲豬瘟抗原檢測方法主要有紅細胞吸附試驗（HAD），直接免疫熒光（DIF）試驗，聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），熒光定量PCR法（RQ-PCR），環(huán)介導等溫擴增技術(shù)等。抗體檢測主要是膠體金試紙條法和ELISA抗體檢測。實時熒光定量PCR是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展擴充的核酸定量技術(shù)，分為相對定量和絕對定量，它具有高靈敏度——精確到單拷貝數(shù)，極寬的動態(tài)范圍可達9個數(shù)量級的檢測范圍，高精確度——重復性好，高準確度——是目前公認的定量金標準[1]。其特點是擴增與檢測能同步進行，快捷方便，八連管內(nèi)閉管反應(yīng)，降低污染風險，檢測方法多種多樣，應(yīng)用靈活[2]。因此，豬場非洲豬瘟診斷實驗室以熒光定量PCR法為基礎(chǔ)來建立。

熒光定量PCR法檢測非洲豬瘟病毒，大概可以分成幾個步驟。首先是核酸物質(zhì)的提?。耗壳俺Ｓ玫?個方法是直接裂解法核酸提取，過濾-裂解法核酸提取，磁珠法核酸提取。然后是PCR的基本原理以及運用：RQ-PCR是通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析[1]，在實時熒光定量PCR反應(yīng)中引入一種熒光化學物質(zhì)，依照相關(guān)的生物學特性，隨著PCR擴增反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)物不斷累積，熒光信號也按等比例不斷增加，這樣就可以通過實時熒光定量PCR檢測平臺——PCR儀，隨著熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而等到一條熒光擴增曲線圖，這樣就通過對熒光信號的變化實現(xiàn)對樣品中ASFV核酸的快速檢測。在選擇引入熒光化學物質(zhì)上最常用到的是TaqMan 探針，它是一種寡核苷酸探針，在PCR擴增反應(yīng)時，在加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針，其結(jié)合位點在兩條引物之間，且只與模板特異性地結(jié)合，熒光報告基團連接在探針的5’末端，而熒光淬滅基團則在3’末端，當完整的探針與目標序列雜交時，熒光基團發(fā)射的熒光信號與3’端的淬滅劑接近而被淬滅，但進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基因與淬滅劑分離，從而通過熒光信號的變化實現(xiàn)對目標模板的相對定量檢測。

根據(jù)對非洲豬瘟病毒基因的認知，在基因位點的選取上，采用TaqMan 探針技術(shù)，對ASFV的P72基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針，配以相應(yīng)試劑進行聚合酶鏈式反應(yīng)。主要成分：ASFV-反應(yīng)液包含引物、探針、Dntp、Mg2+、PCR緩沖液等；酶混合物包含熱啟動Taq酶、UNG酶；設(shè)置陽性對照包含非洲豬瘟病毒P72基因序列；陰性對照為空載的滅菌TE溶液即可；內(nèi)置參照包含內(nèi)置參照序列，一般為外源基因序列片段。

其中通過檢測內(nèi)置參照是否正常來監(jiān)測樣本中是否具有PCR抑制物，從而避免假陰性；通過減少樣本間的交叉污染、實驗室設(shè)備的污染、前次PCR擴增產(chǎn)物和引物殘余污染可減少假陽性。然后是在實時熒光定量PCR檢測平臺完成檢測，即PCR儀，通過對熒光信號的變化實現(xiàn)對樣品中ASFV核酸的快速檢測。從而得到每個樣品的擴增曲線，實現(xiàn)對樣品的非洲豬瘟病毒檢測。根據(jù)擴增曲線圖（見圖1），對每個樣品每個通道的擴增曲線進行分析解讀，首先是否為顯著的“S”型擴增曲線，陽性對照的CT值是否在“預期”的位置；陰性對照是否報告CT值。

1.2 建立分子檢測實驗室

建立分子檢測實驗室，一要合理分區(qū)，按區(qū)域劃分為試劑儲存、樣品前處理區(qū)，樣品處理區(qū)，PCR擴增體系配制區(qū)，PCR擴增與結(jié)果分析區(qū)。二要保證區(qū)域單向流動且具有獨立的通風系統(tǒng)。同時配備專業(yè)的檢測人員，熟悉PCR檢測原理，熟練掌握操作步驟，責任心強，工作認真負責，能及時發(fā)現(xiàn)并解決問題，對樣品的質(zhì)量進行把關(guān)，對實驗數(shù)據(jù)進行收集整理，總結(jié)經(jīng)驗。三是配備專業(yè)實驗器材。包括PCR檢測儀、超凈工作臺、高速離心機、振蕩器、移液槍、PCR級實驗耗材。四是建立檢測實驗室與生產(chǎn)的反饋流程，了解檢測/監(jiān)測的目的-問診及信息填寫-采樣方案的制定-采樣-檢測及結(jié)果分析-反饋結(jié)果-采取措施后的再次檢測及數(shù)據(jù)對比，發(fā)揮實驗室診斷對生產(chǎn)的指導作用。

2 非洲豬瘟的防控措施

自2018年8月3日我國通報首例非洲豬瘟疫情以來，國內(nèi)總體防控形勢嚴峻，已對我國的生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成較大沖擊，且由于該病毒沒有安全有效的上市疫苗產(chǎn)品，同時傳播速度極快、死亡率極高的，因此建立健全養(yǎng)殖場非洲豬瘟防控體系尤為重要。

2.1 目前非洲豬瘟防控難點

2.1.1 環(huán)境中病毒流通風險大

大量活豬仔豬跨省跨區(qū)域的頻繁流動，有造成非洲豬瘟蔓延的較大風險，在一些地區(qū)不法商販將病豬或者攜帶病毒的豬肉及其豬肉制品違規(guī)販賣入市場進行交易流通，這就變成了非洲豬瘟看不見的傳染源。而國際旅游的旅客回國時，攜帶的肉制品，如果處理方法不科學，沒有有效的滅活病毒，這些都是環(huán)境中病毒傳播風險[3]。

2.1.2 生豬復養(yǎng)防控信心不足

在目前沒有非洲豬瘟疫苗的大背景下，生豬復養(yǎng)的難度極大，第一輪的非洲豬瘟疫情帶來的對養(yǎng)豬業(yè)的破壞力以及嚴重的經(jīng)濟損失，極大地打擊了養(yǎng)殖者的養(yǎng)殖信心。同時隨著非洲豬瘟疫情的快速蔓延，養(yǎng)殖戶沒有放心可靠的豬苗來源；另一方面，中小養(yǎng)殖戶發(fā)生疫情后空置的欄舍的洗消以及復養(yǎng)的安全性得不到有效保障，根據(jù)相關(guān)防疫要求的設(shè)備設(shè)施改建，也是一個大工程，而造成資金、心理壓力以及優(yōu)質(zhì)豬苗來源難等多重壓力，沒有科學的評估和有效的復養(yǎng)方案很難開啟復養(yǎng)的步伐。

2.1.3 全社會共同防控的責任與體系建設(shè)有待健全

養(yǎng)殖行業(yè)職能及監(jiān)管部門應(yīng)強化落實防控主體責任，加強防控應(yīng)急處理。首先社會監(jiān)管措施要落實到位，不能停留在表面。之前養(yǎng)豬場主體責任認識度不高、落實不全的問題要糾正過來，一旦發(fā)現(xiàn)可疑病例，應(yīng)及早上報，檢測排除隱患。有部分養(yǎng)殖人員仍然存在僥幸心理，認為過了風頭再養(yǎng)就沒有問題，但是防疫措施如果不落實，復養(yǎng)成功的概率仍然較低。

2.1.4 豬場防控管理難度大

在嚴峻的大背景環(huán)境污染情況下，外環(huán)境病毒傳播情況不樂觀，若對養(yǎng)豬場的生產(chǎn)生活物資，以及人員流通的管理檢測不規(guī)范不仔細，病死豬淘汰處理不當，與外界接觸極易造成交叉感染。豬場生產(chǎn)人員長時間的封場，得不到很好的休假，人身不自由，這也會導致養(yǎng)殖團隊的不穩(wěn)定，以及人員極大的精神壓力，管理難度較大。很多養(yǎng)殖場還沒有建立檢測體系、預警體系/應(yīng)急體系，發(fā)生疫情后容易造成極大的損失，對養(yǎng)殖場的防控打擊很大。

2.2 防控策略

2.2.1 加強流通環(huán)節(jié)的管理

所有養(yǎng)殖上下游行業(yè)都應(yīng)該主動配合相關(guān)部門對市場上的生豬及豬肉制品進行嚴格的流通管理，加大對運輸環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度，這樣才能夠從根本上對大環(huán)境的疫情程度改善有幫助，從源頭來控制ASF疫情的再傳播。監(jiān)管部門要根據(jù)《關(guān)于在加工流通環(huán)節(jié)開展非洲豬瘟病毒檢測公告》，落實保障人民利益和食品安全，維護生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，極大降低生豬及豬肉制品在流通環(huán)節(jié)被感染非洲豬瘟的風險。

2.2.2 生物安全體系建立

養(yǎng)殖場要不斷學習，加強危機意識，完善精準“拔牙”，果斷處理感染豬只。加大科普力度，提高生豬養(yǎng)殖人員的生物安全意識，并建立合理合規(guī)的操作流程，切實將責任落實到具體單位和個人，對豬只和豬舍周邊環(huán)境及生產(chǎn)物資進行周期性監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)異常情況例如豬只發(fā)燒不食黏膜發(fā)紺等，就立即要加大核酸檢測力度，發(fā)現(xiàn)可疑或者確診非洲豬瘟病例，立即上報當?shù)匦竽莲F醫(yī)管理部門，發(fā)生疫情立即將病豬撲殺和銷毀，并進行無害化處理，嚴防疫情擴散[4]。養(yǎng)殖場要加強防控設(shè)施的建設(shè)，盡可能完善生物安全體系，對于部分關(guān)鍵控制點客觀條件不能完善的，要決斷地退出養(yǎng)殖，不然后患無窮。

2.2.3 加強飼料生物安全管理

要不斷加強飼料和飼養(yǎng)管理。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第64號公告的規(guī)定，明確了飼料廠不得再以豬血作為原料進行飼料生產(chǎn)和銷售。飼料廠應(yīng)做好廠區(qū)內(nèi)外生物安全管理，做好人員車輛烘干和消毒工作。對于部分風險較大的原料，應(yīng)及時做好采樣檢測，合格后才能使用。做好飼料加工工藝的優(yōu)化，相應(yīng)地增加調(diào)質(zhì)時間，增加保質(zhì)器等手段，延長蒸汽調(diào)制和保質(zhì)時間，殺滅病毒。最后應(yīng)嚴厲禁止泔水直接飼喂豬只，以免造成傳播非洲豬瘟病毒的風險，保障養(yǎng)殖安全[5]。

2.2.4 其他措施

養(yǎng)殖場需要建立自己的檢測實驗室、烘干房、各級洗消點，配套專門的中轉(zhuǎn)車輛。制定具體的生物安全防控措施，加強對補欄前豬只的檢測與存欄豬只的各類監(jiān)測，以及各類人員物資進出通道的明確，生活生產(chǎn)物資進入處理辦法，淘汰豬處理方案和具體實施措施。不給病毒從外界傳入的機會，確保安全生產(chǎn)。

3 小結(jié)

非洲豬瘟作為養(yǎng)豬業(yè)目前嚴重的疫病之一，極大地影響了養(yǎng)豬行業(yè)的發(fā)展，因此，我國相關(guān)部門也在不斷制定嚴格的疫情控制方案，深入探究非洲豬瘟的感染風險，制定了多項科學合理的防控措施，用以來提高我國養(yǎng)豬業(yè)養(yǎng)殖水平。養(yǎng)豬場也應(yīng)建立健全生物安全防控措施，做好非洲豬瘟的診斷與防控措施，提高生產(chǎn)成績。