呂俏平 程小愛

摘?要：為測定歐李過氧化氫與多酚氧化酶活性的變化，探索水澇脅迫對(duì)歐李生長的影響，利用歐李提取液與硫酸鈦反應(yīng)后生成過氧化物，即鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被硫酸溶解，測定溶解液在415 nm波長下的吸光度值，判斷過氧化氫的含量。再以鄰苯二酚為底物，利用多酚氧化酶將其氧化為鄰苯二醌，在525 nm下利用分光光度法檢測吸光度的變化，判斷多酚氧化酶活性的變化。結(jié)果顯示，168 h內(nèi)過氧化氫的含量表現(xiàn)為先減后增，隨后再減的趨勢，而酶活性表現(xiàn)為先減后增，且對(duì)照組與水澇脅迫組變化趨勢相同。通過對(duì)比對(duì)照組和水澇脅迫組過氧化氫含量和多酚氧化酶活性的變化，短時(shí)間的水澇對(duì)歐李的生長影響不大，為后期引種奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：歐李;水澇脅迫;過氧化氫;多酚氧化酶

文章編號(hào)：2096-8108（2020）01-0001-05?中圖分類號(hào)：S662.3?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：In order to determine the change of the activity of hydrogen peroxide and polyphenol oxidase in Cerasus humilis，the effect of water-logging stress on the growth of it was explored. The peroxide was formed by the reaction of plum extract with titanium sulfate， that is， the yellow precipitation of titanium complex， which could be dissolved by sulfuric acid. The absorbance of the dissolved solution at 415 nm wavelength was determined and the content of hydrogen peroxide was determined. Then catechol was used as substrate， polyphenol oxidase was used to oxidize it to catechol， and the absorbance was detected by spectrophotometry under 525 nm， and the change of polyphenol oxidase activity was judged. The result showed that within 168 h， the content of hydrogen peroxide decreased， then increased， and then decreased， while the enzyme activity decreased and then increased， and the change trend of the control group was the same as that of the waterlogging stress group.By comparing the changes of hydrogen peroxide content and PPO between the control group and the waterlogging stress group， the short-term waterlogging had little effect on the growth of Cerasus humilis， which laid a theoretical foundation for the later introduction.

Keywords：Cerasus humilis; Water logging stress; Hydrogen peroxide; Polyphenol oxidase

歐李（Cerasus humilis），薔薇科櫻桃亞屬的一種抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)的野生果樹，是我國特有的樹種，主要分布在中西部地區(qū)的山西、河北、陜西、內(nèi)蒙和東北地區(qū)[1-2]。其植株較小，株高僅0.5～1 m，枝條細(xì)密，葉芽密集，花白色或粉色。結(jié)果早，果似櫻桃，味似李子，酸甜適口。歐李果實(shí)中含有各種對(duì)人體有益的礦質(zhì)元素，尤其是鈣元素的含量比一般的水果都高，因而便有了‘鈣果[3]之稱。歐李經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，用途非常廣泛。果樹在綠化美化環(huán)境、治理荒山沙漠、防治水土流失方面具有特殊的效果，被國家林業(yè)局列為生態(tài)林優(yōu)良樹種。果肉可食，仁可入藥，莖可作飼料和編織材料，其開發(fā)利用前景非常廣闊。

水澇脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的危害被稱為澇害，使得植物細(xì)胞內(nèi)自由基平衡招遭到破壞。隨著水澇程度的加深，細(xì)胞內(nèi)的活性氧大量積累，會(huì)使過氧化氫迅速產(chǎn)生，過氧化氫可以直接或間接地氧化細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡[6]。而多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）是植物體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶，與植物抗逆作用有極大的關(guān)系。衰老、逆境脅迫以及病原菌、病蟲侵害都能引起PPO活性的變化[7]。因此本實(shí)驗(yàn)通過測定歐李在水澇脅迫下的過氧化氫與多酚氧化酶活性的變化，進(jìn)一步了解歐李在水澇情況下的生長機(jī)制，分析其原因，為探討歐李植物的抗逆性提供理論依據(jù)。

1?試驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1?植物材料

歐李選自成都大學(xué)種植基地，取8株（2株備用）長勢良好的歐李植株，將其放置于室內(nèi)正常培養(yǎng)。首先采用雙套盆法對(duì)3株植株進(jìn)行水澇脅迫處理，使水位淹沒至植株根莖處。另外3株作為對(duì)照組，在正常條件下培養(yǎng)，不做任何處理。

1.2?試驗(yàn)試劑

pH5.9的0.05 mol/L磷酸緩沖液：取Na2HPO40.8903 g， NaH2PO46.3734 g，將以上試劑溶解于800 mL蒸餾水，定容至1 L;20%的三氯乙酸溶液：稱取20 g三氯乙酸，溶解于100 mL蒸餾水中;0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液：稱取1.1011 g鄰苯二酚，溶解于蒸餾水中，定溶至100 mL;10 μmol/LH2O2丙酮試劑：取30%分析純H2O257 μL，溶于100 mL丙酮中;還有2 mol/L硫酸、5%（W/V）硫酸鈦、濃氨水、石英砂等試劑均為分析純。

1.3?儀器

CT15RT型高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）;7200 型可見光分光光度儀（尤尼柯上海儀器有限公司）;FA2004B型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）;DB-210SCB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（成都天宇試驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司）;冰箱（海爾）;移液管（5 mL、2 mL、1 mL）;移液槍（250 μL）;離心管（5 mL）8支;容量瓶;燒杯;研缽;剪刀;洗耳球。

2?試驗(yàn)方法

2.1?過氧化氫測定

2.1.1?過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

實(shí)驗(yàn)參考湯紹虎，羅充主編的《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程》的方法[8]，取5 mL離心管7支，依順序編號(hào)，并按表1加入試劑。

待沉淀完全溶解后，將其小心轉(zhuǎn)入5 mL容量瓶中，并用蒸餾水少量多次沖洗離心管，將洗滌液合并后定容到5 mL，然后415 nm波長下測定吸光度。

2.1.2?過氧化氫提取測定

取植物當(dāng)年生枝條上的葉片，洗凈擦干并稱重，用剪刀將其剪碎，然后置于預(yù)冷的研缽中，加入少量石英砂，再加入少量液氮將其研磨成細(xì)小的粉末，然后轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管，按材料與提取劑11的比例加入4 ℃下預(yù)冷的丙酮，將研缽用少量的丙酮分3次洗凈，清洗液合并入上述離心管中，放入高速離心機(jī)中，在4 ℃3 000 r/min下離心15 min，棄去濾渣，上清液即為過氧化氫提取液。用移液管吸取樣品提取液1 mL，按表1加入5%硫酸鈦和濃氨水，待沉淀形成后5 000 rpm/min離心10 min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌3～5次，直到去除植物色素。向洗滌后的沉淀中加入2 mol硫酸5 mL，待完全溶解后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色，按表1測定其吸光度。

2.1.3?過氧化氫計(jì)算公式

2.2?多酚氧化酶測定

2.2.1?多酚氧化酶粗酶液的制備與測定

取植物當(dāng)年生枝條上的葉片，洗凈擦干，稱重，用剪刀將其剪碎，然后置于預(yù)冷的研缽中，加入少量石英砂，再加入0.5 g不溶性聚乙烯吡咯烷酮和pH5.9緩沖溶液，冰浴研磨成勻漿。將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。另取一試管中加入3.9 mL 0.05 mol/L pH5.9的磷酸緩沖液、1.0 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液，在37 ℃恒溫水浴中保溫2 min，然后加入0.1 mL粗提液，迅速搖勻。在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min后，迅速取出試管放置在冰浴中，并加入2 mL 20%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。在5 000 r/min下離心10 min，取上清液于525 nm波長處以時(shí)間掃描方式，在1～5 min內(nèi)測定吸光度變化。

2.2.2?多酚氧化酶計(jì)算公式

3?結(jié)果與分析

3.1?過氧化氫測定結(jié)果分析

3.1.1?過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)表1的方法得到的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2 782x-0.0 005，R2=0.9 994。根據(jù)吸光度值制作出的過氧化氫濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，過氧化氫濃度與吸光度間線性關(guān)系良好，可以用于后續(xù)過氧化氫含量的測定。

3.1.2?過氧化氫含量的變化

測歐李在水淹168 h過程中過氧化氫含量的變化，一個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每天早上9-11時(shí)取樣，每隔24 h測1次，每組做3個(gè)平行，來研究水澇下歐李葉片中過氧化氫含量的變化，得到的數(shù)據(jù)見表2、表3和圖2。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的變化趨勢基本相同，實(shí)驗(yàn)組的過氧化氫的含量略高于對(duì)照組，而在后72 h里都是先增后減。說明歐李在受到水澇脅迫24 h后，過氧化氫濃度較高，而24～96 h里，植物受到脅迫后體內(nèi)會(huì)生成很多抗氧化酶類并保持較高的活性，可以清除多余的氧自由基，使得過氧化氫含量逐漸減少。而100～140 h里過氧化氫突然升高，又下降，可能是由于100～140 h時(shí)天氣溫度的突然升高，使得歐李又受到了高溫脅迫所導(dǎo)致的，140 h后是由于體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的增強(qiáng)來抵御脅迫所引起過氧化氫含量的下降。

3.2?多酚氧化酶測定結(jié)果分析

根據(jù)PPO活性計(jì)算公式，計(jì)算168 h內(nèi)酶活性變化，得到圖3中所示的水澇脅迫組與對(duì)照組酶活性變化對(duì)比圖。其中對(duì)照組前144 h內(nèi)，PPO活性持續(xù)下降，和培養(yǎng)天數(shù)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性，并在120 h時(shí)達(dá)到最低值36.59，而144～168 h內(nèi)，PPO的活性極速上升，而且幅度較大，在168 h時(shí)達(dá)到最大74.69，基本上達(dá)到實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的酶活。而水澇脅迫組前144 h內(nèi)，PPO活性趨于平穩(wěn)，且非常接近對(duì)照組PPO活性的最低值36.59，對(duì)其進(jìn)行顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)P>0.05，所以水澇脅迫組PPO活性與對(duì)照組最低PPO活性值無明顯差異。而144～168 h內(nèi)，變化趨勢也與對(duì)照組相同，PPO活性迅速增加，在168 h達(dá)到最大值62.54，完全高于前144 h內(nèi)的酶活性水平。觀察兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組PPO活性到達(dá)拐點(diǎn)的過程是緩慢呈線性下降的，而水澇脅迫組則是從開始就急速降低至最低值，并且在此期間保持基本穩(wěn)定。PPO活性與光合作用效率密切相關(guān)，對(duì)照組通過抑制光反應(yīng)，間接影響暗反應(yīng)速率，所以造成緩慢下降的態(tài)勢;水澇脅迫組直接抑制暗反應(yīng)的進(jìn)行，因此，PPO活性的變化相比對(duì)照組更加直接和快速。而在144 h后PPO活性突然升高，是由于光合作用所產(chǎn)生的營養(yǎng)成份無法滿足植物需求時(shí)，植物就會(huì)產(chǎn)生對(duì)弱光的抗逆反應(yīng)。植物通過提升PPO的含量，提高了光合作用電子傳遞鏈傳遞電子的效率，從而提高了光合作用效率，一定程度上保護(hù)了植物的生長。通過比對(duì)兩組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)二者之間的差異不明顯，PPO活性上升時(shí)間，上升幅度基本相同。因此短時(shí)間的水澇脅迫不會(huì)對(duì)歐李的生長造成太大的影響。

4?結(jié)論

歐李是一種具有龐大的根群，植株繁茂，具有固沙、抗蝗、耐旱、耐寒、耐鹽堿等減災(zāi)功能的優(yōu)良樹種。不論從水土保持、荒漠化治理、退耕還林，還是干旱、半干旱區(qū)域生態(tài)修復(fù)等方面來看，在成都地區(qū)引種歐李都具有極大的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9-10]。成都地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，如果要將歐李引入，就必須考慮水澇脅迫對(duì)歐李生長可能造成的影響。本研究就通過觀察歐李受到水澇脅迫后的過氧化氫的含量和多酚氧化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)水澇脅迫組的過氧化氫含量高于對(duì)照組，但增加不顯著且變化趨勢基本一致;再從多酚氧化酶的變化情況來看，水澇脅迫組前144 h內(nèi)，由于植株受到水澇脅迫，氣孔關(guān)閉且光照減少，嚴(yán)重影響了光合作用速率導(dǎo)致了PPO活性的降低，但最低值與對(duì)照組基本一致，且變化不顯著，而144 h后對(duì)照組與脅迫組的PPO活性都顯著增加且趨勢一致。綜合過氧化氫含量和多酚氧化酶分析發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間內(nèi)，歐李對(duì)水澇脅迫有較好的耐受性，為歐李引種成都種植奠定了理論基礎(chǔ)。

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