靳計(jì)燦，劉海峰，黎根盛，李瑞，林銳，曾暉，張少雄

(1.中山大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，廣東 珠海 519082；2.中山大學(xué) 廣東新材料產(chǎn)業(yè)基地聯(lián)合研究中心，廣東 佛山 528244；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510640；4.廣東優(yōu)凱科技有限公司，廣東 佛山 528244)

由于人們對綠色洗滌劑產(chǎn)品需求的提高，而酶制劑正是綠色化學(xué)工藝中的理想催化劑[1]，這就為含酶洗滌劑的發(fā)展提供了契機(jī)。對于洗滌劑用酶，可以追溯到20世紀(jì)60年代，丹麥諾沃公司推出了一種來自地衣芽孢桿菌的細(xì)菌內(nèi)蛋白酶，作為洗滌配方的成分[2]，使洗滌用品的去污效果得到大大提高。初期的洗滌產(chǎn)品大部分都是粉末，隨著包裹造粒等技術(shù)的發(fā)展，使酶與洗滌配方體系中的組分相隔絕開，減少了酶與其它組分的接觸，從而使粉狀的洗滌產(chǎn)品的酶穩(wěn)定性問題得到了解決。但是隨著粉狀洗滌劑向液體洗滌劑的轉(zhuǎn)變，酶的穩(wěn)定性問題再一次成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)，成功地使用酶助劑已經(jīng)成為生產(chǎn)具有成本效益、對環(huán)境無害的驅(qū)動(dòng)力，酶制劑的加入對于各類型洗滌產(chǎn)品的創(chuàng)新發(fā)展均具有很大的助推力[3]。但是酶制劑因?yàn)槠渖飳傩允蛊湓谙礈靹┕I(yè)應(yīng)用中特別容易受到外界影響而失去活性。所以，研究酶在洗滌劑溶液中(主要是表面活性劑溶液)的穩(wěn)定性，探討洗滌劑配方組分的表面活性劑等組分對酶的活性的影響，是一個(gè)非常重要的課題。

本文主要介紹了近年來酶在表面活性劑溶液中的穩(wěn)定性研究進(jìn)展，并進(jìn)一步探討了復(fù)合酶在液體洗滌劑中的穩(wěn)定性問題，對酶在洗滌領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 單一酶在表面活性劑溶液中的穩(wěn)定性

為了使酶制劑在洗滌或清潔劑中使用，其存儲(chǔ)期間的穩(wěn)定性和清潔性能在很大程度上取決于各個(gè)組分的混合物[4]，其中表面活性劑是洗滌劑中最關(guān)鍵的組分，是洗滌劑中的重要去污組分，但是表面活性劑與酶之間的相互作用，能夠使酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使其失活[5]，所以探討不同洗滌劑用酶在表面活性劑溶液中的穩(wěn)定性是一個(gè)非常重要的研究課題。

1.1 蛋白酶

蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶[6]。在洗滌劑種類中，蛋白酶可以說是最重要、應(yīng)用最廣泛的酶，這是因?yàn)橄衲?、血、汗?jié)n等蛋白質(zhì)占據(jù)了織物污垢的大多數(shù)，而且表面活性劑和其他助洗劑很難將其去除。在很多文獻(xiàn)的研究中，對于含酶洗滌劑配方體系，蛋白酶對于陰離子型表面活性劑的敏感性特別大，相對于陰離子表面活性劑，非離子表面活性劑引起的問題要少得多[7]。

楊慶利等[8]研究了常用的陰離子表面活性劑對液體蛋白酶的影響，發(fā)現(xiàn)了在液相混合組分中，由陰離子表面活性劑所電離的離子所帶的電荷會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且其疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)可能會(huì)分別與酶分子相互作用，從而影響酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各表面活性劑影響程度如下：LAS>AOS>AES>AEC，可以看出AEC的離子強(qiáng)度以及表面活性劑分子與酶的作用力相比其他表面活性劑來說是最弱的。

吳美娜等[9]基于洗衣液的主要成分考察了表面活性劑AES、AEO、APG等對蛋白酶活性的影響，結(jié)果分析可知，添加非離子表面活性劑吐溫系列和APG系列的酶活性低于添加硼砂穩(wěn)定劑的酶活，但是優(yōu)于空白試驗(yàn)的酶活，可見系列非離子表面活性劑對酶活的穩(wěn)定性保持起到了一定的作用；非離子表面活性劑AEO7和AEO9對于酶的活性基本沒有影響，但是酶分子與陰離子表面活性劑AES之間的相互作用會(huì)顯著降低酶的活性，而且對于混合表面活性劑體系，在未來可以增加 AEO與APG的混合使用，因?yàn)锳EO與AES的混合使用并不會(huì)有效地提高液體酶的活性。

目前，很少有人對酶與表面活性劑之間的相互作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究，所以表面活性劑是怎么與酶相互作用使其失活的，這仍然是該領(lǐng)域面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。Zhang等[10]研究了AES、AEO、APG表面活性劑的結(jié)構(gòu)對蛋白酶活性的影響，結(jié)果表明，陰離子表面活性劑LAS對酶活的影響最大，這主要是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中存在苯環(huán)；非離子表面活性劑AEO系列對酶有較小的影響，且其結(jié)構(gòu)中環(huán)氧乙烷的個(gè)數(shù)越多，對酶的影響就越大；APG非離子表面活性劑比AEO對酶的影響還小，原因是除了其無法在水溶液中進(jìn)行電離之外，還有就是在相同的疏水基團(tuán)下，葡萄糖親水基團(tuán)比環(huán)氧乙烷基團(tuán)對蛋白酶的影響更小。

關(guān)于含酶洗滌劑的開發(fā)，探索更適合洗滌環(huán)境的酶也十分重要。Haddar等[11]選用來自于莫來芽孢桿菌A21的兩種絲氨酸堿性蛋白酶(BM1和BM2)，發(fā)現(xiàn)兩者在洗滌劑濃度下對于吐溫80和Triton X-100此類的非離子表面活性劑均顯示出高穩(wěn)定性，其中BM1和BM2兩種蛋白酶的最適宜的pH值分別是8～10和10，在高堿性條件下能保持高活性的特性使其成為理想的酶制劑。

1.2 脂肪酶

脂肪酶能夠?qū)⑻烊坏孜镉椭呋到獬芍舅岬任镔|(zhì)，譬如油漬類的污垢就能夠被有效的去除[12]，由于脂肪酶的這種特性，越來越多的研究開始將脂肪酶應(yīng)用到其高端洗滌產(chǎn)品中。關(guān)于表面活性劑對脂肪酶活性的影響，人們探討最多的還屬陰離子表面活性劑，該類表面活性劑由于具有優(yōu)異的清潔性能和相關(guān)的低生產(chǎn)成本，被用于大多數(shù)洗滌劑配方中，特別是那些具有脂肪族十二烷基的表面活性劑，由于在乳化效率和水溶性之間的折衷性，這些表面活性劑是首選的。在眾多表面活性劑中，十二烷基硫酸鈉(SDS)和具有兩個(gè)EO單元的十二烷基醚硫酸鈉(SLE2S)，是工業(yè)應(yīng)用中常見的表面活性劑，由于其結(jié)構(gòu)相似(見圖1)，所以Magalhaes等[13]從表面活性劑的結(jié)構(gòu)對酶的活性的影響進(jìn)行研究，評估了陰離子表面活性劑的乙氧基團(tuán)(EO)對脂肪酶的結(jié)構(gòu)和活性的作用，在上述兩種表面活性劑的存在下，評估蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化和酶活性。結(jié)果表明，表面活性劑中的EO單元的存在決定了酶的穩(wěn)定性和活性，SDS促使酶的變性和相應(yīng)的活性損失，而SLE2S保持酶的結(jié)構(gòu)和活性；該項(xiàng)工作的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了蛋白質(zhì)基團(tuán)之間的靜電相互作用，因吸附的陰離子表面活性劑的存在而發(fā)生改變，這種吸附主要是由疏水相互作用驅(qū)動(dòng)的。

圖1 十二烷基硫酸鈉(SDS)和十二烷基醚硫酸鈉(SLE2S)的結(jié)構(gòu)圖[13]Fig.1 Structural diagram of sodium dodecyl sulfate(SDS)and sodium dodecyl ether sulfate(SLE2S)

Nerurkar等[14]選擇了一種從海洋細(xì)菌提取的脂肪酶作為酶添加劑摻入洗滌劑溶液，考察了在1%(w/v)的酶濃度下與不同的表面活性劑和洗滌劑在40 ℃下孵育1 h的效果，結(jié)果表明脂肪酶活性在表面活性劑(山梨醇酐油酸脂Span-80、三聚磷酸鈉)、水柔軟劑(硫酸鈉)、氧化劑(過硼酸鈉四水合物)和AATCC洗滌劑的存在下與空白對照樣品對比是增加的(圖2)，在此基礎(chǔ)上又考察了其去除玉米油的效率，發(fā)現(xiàn)在洗滌劑中添加脂肪酶顯著提高了織物上玉米油的去除效率(約20%)；而且該脂肪酶具有堿性最適pH值以及在廣泛的溫度范圍內(nèi)仍能保持高活性、高穩(wěn)定性，說明該類脂肪酶適合用作洗滌劑配方中的添加劑。

圖2 不同表面活性劑和洗滌劑對脂肪酶活性的影響[14]Fig.2 Effects of different surfactants anddetergents on lipase activity

1.3 淀粉酶

淀粉酶能夠?qū)⒋蠓肿拥牡矸鄞呋獬尚》肿拥倪€原糖等物質(zhì)，所以將其應(yīng)用于洗潔精中，可有效去除含有淀粉基的污漬，如盤子上的米糊，糊狀的馬鈴薯等。基于此，葉飛燕[15]研究了洗潔精中常用的表面活性劑對液體淀粉酶的穩(wěn)定性影響，結(jié)果表明幾種表明活性劑對酶的負(fù)影響程度為LAS>AOS>AES>AEO9，不過非離子表面活性劑AEO9與LAS復(fù)配后會(huì)顯著提高酶的穩(wěn)定性，而且在配方體系中加入穩(wěn)定劑氯化鈣，能夠顯著提高酶的穩(wěn)定性，推測可能是由于鈣離子與酶的結(jié)合對酶的活性有激活作用[16]。Singh等[17]測定不同濃度的表面活性劑和酶復(fù)配后的生物降解性，發(fā)現(xiàn)含有1%淀粉酶和0.118 g十二烷基硫酸鈉的樣品以及含有1%淀粉酶和2.7 μL吐溫20的樣品生物降解性最小，因此，該濃度的淀粉酶和表面活性劑復(fù)配體系可以用于具有高降解性的洗滌劑配方。

1.4 纖維素酶

纖維素酶可以有效地將纖維素分解成寡糖或單糖，可除去微纖維和附著在微纖維上的顆粒污垢，對織物表面起更新作用。纖維素酶被添加到洗滌劑中，可提高織物的平滑度，而不會(huì)對其造成損害，從而保持織物的質(zhì)量[18]。在表面活性劑溶液條件下，研究其與纖維素酶的作用機(jī)理有一些報(bào)道，但是很少有報(bào)道用相應(yīng)的表征手段對其作用機(jī)理進(jìn)行合理的解釋，于躍等[19]通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、熒光光譜及傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(ATR-FTIR)探討了表面活性劑和纖維素酶的相互作用機(jī)理，DLS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在陰離子表面活性條件下，陰離子表面活性劑的磺酸基團(tuán)具有較大的電離度，極大地促進(jìn)了酶分子表面與表面活性劑之間發(fā)生吸附作用，進(jìn)而改變了纖維素酶的結(jié)構(gòu)，所以研究體系中的Zeta電位分布在較低的負(fù)電荷區(qū)域；而非離子表面活性劑-纖維素酶與蒸餾水-纖維素酶體系中的Zeta電位的分布沒有明顯的區(qū)別，主要是因?yàn)榉请x子表面活性劑與酶分子之間的相互作用依靠于氫鍵，并不會(huì)導(dǎo)致纖維素酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且非離子表面活性劑亦不會(huì)電離出帶電荷的離子基團(tuán)來影響酶分子結(jié)構(gòu)。熒光ATR-FTIR 實(shí)驗(yàn)說明了陰離子表面活性劑對纖維素酶的二級結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈的微環(huán)境都有很大的影響；在很多洗滌劑配方中含有不止一種類型的表面活性劑，而且混合物表面活性劑相比僅含有單一種類的表面活性劑其CMC值會(huì)有所降低且性能更好[20]，所以在該項(xiàng)工作中還測試了混合表面活性劑對酶的影響，實(shí)驗(yàn)中采用陰離子表面活性劑AES(2EO)和非離子表面活性劑AEO2復(fù)配，結(jié)果顯示，加入AEO2能夠顯著地改善AES(2EO)與纖維素酶的兼容性，這主要是因?yàn)閺?fù)配后形成了混合膠束，在以陰離子表面活性劑為主的膠束中插入了非離子表面活性劑，使相鄰分子間的電荷斥力降低，從而形成了更小的膠束，而且膠束的電荷密度降低，對酶活力影響變小[21]。

由于生產(chǎn)成本較高，纖維素酶的利用受到阻礙，未來的趨勢是開發(fā)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)和綠色生物技術(shù)[22]，以實(shí)現(xiàn)可持續(xù)增長。因此，尋找具有更好特性的纖維素酶是一項(xiàng)持續(xù)的工作。

2 復(fù)合酶在表面活性劑溶液中的穩(wěn)定性

很多含酶洗滌劑只含有單一種類的酶，但是單一種類的酶無法去除多種污垢，這是因?yàn)槊复呋磻?yīng)具有專一性，在工業(yè)生產(chǎn)中只添加一種酶制劑是無法生產(chǎn)出高效去污的產(chǎn)品。因此，在洗滌產(chǎn)品中需要加入多種酶，比如纖維素酶與其他酶進(jìn)行 1∶1 復(fù)配時(shí)，去污效果得到了顯著的提升，這是因?yàn)閺?fù)配酶中的纖維素酶能夠使織物的纖維結(jié)構(gòu)蓬松起來[23]，使其它酶能夠充分地與嵌入在纖維結(jié)構(gòu)中的污漬相互作用，進(jìn)而提高了其去污的效果。張紅艷等[24]以堿性蛋白酶的相對活性作為衡量指標(biāo)，研究了8種常用表面活性劑在不同體系下對去血漬復(fù)合酶活性的影響，結(jié)果表明，在這些表面活性劑中，有7種表面活性劑可以很好的與酶穩(wěn)定的共存，可有效地發(fā)揮各組分的去污作用，只有LAS不利于酶的穩(wěn)定性，但是如果LAS與其他組分分別按照同等比例混合的話，可顯著減少LAS對酶活的負(fù)面影響，這說明表面活性劑之間適當(dāng)復(fù)配可有效地增強(qiáng)液體酶的穩(wěn)定性。不過需要注意的是在含有多酶復(fù)合的洗滌劑中，其中的酶不僅能夠?qū)ξ蹪n進(jìn)行降解，而且也會(huì)對洗滌劑配方體系中其他酶進(jìn)行降解。所以，既要解決酶與表面活性劑等其它組分的共存問題，也需要解決酶與酶之間的共存問題。Fang等[25]發(fā)明了一種穩(wěn)定液體復(fù)合酶洗滌劑中脂肪酶和蛋白酶的方法，通過一定的方法制備囊泡包裹的蛋白酶溶液和囊泡包裹的脂肪酶溶液，使其混合形成囊泡濃縮液，得到的酶泡濃縮液直接用于洗衣液中，其脂肪酶不會(huì)被蛋白酶降解，而且囊泡中的酶還能抵抗表面活性劑的抑制。在液體洗滌劑中，為了降低蛋白酶對淀粉酶活性的影響，往組分體系中加入一定比例的4-甲酰苯基硼酸來抑制蛋白酶的活性，而在經(jīng)水稀釋后的實(shí)際洗滌濃度下蛋白酶的活性并不會(huì)受到抑制，即不會(huì)影響蛋白酶去污功效的發(fā)揮，從而提高了兩種酶的協(xié)同去污效率[26]。

對于酶制劑的應(yīng)用，國內(nèi)市場與國外發(fā)達(dá)市場最大的差距就在于復(fù)合酶的使用，國內(nèi)目前絕大部分洗滌產(chǎn)品只使用了單一酶[27]，很少使用復(fù)合酶，在這方面國內(nèi)對于復(fù)合酶制劑的研究與開發(fā)仍需要很多的工作要做。

3 展望

在液體洗滌劑中，保持酶的穩(wěn)定性重點(diǎn)在于解決表面活性劑與酶的配伍問題。鑒于表面活性劑與酶的使用種類不同，所以需要研究說明哪種表面活性劑最有利于酶的穩(wěn)定性以此作為指導(dǎo)原則。作為一般性規(guī)則，非離子表面活性劑一般情況下比離子型表面活性劑對酶更有利，這種差異主要?dú)w因于表面活性劑與酶的綁定模式的不同，非離子表面活性劑只能通過疏水相互作用與酶結(jié)合，而離子型表面活性劑可以通過靜電吸引和疏水相互作用結(jié)合。為了能夠更好地提高液體酶穩(wěn)定性，除了研究表面活性劑與酶的配伍之外，人們往往還會(huì)關(guān)注穩(wěn)定劑及其多組分的最優(yōu)配伍方面，這對于酶制劑的工業(yè)應(yīng)用起到了至關(guān)重要的作用。而且，隨著綠色環(huán)保的要求逐漸提高，在未來開發(fā)與酶更適配的綠色表面活性劑、穩(wěn)定劑等洗滌劑成分將會(huì)成為重要的研究方向；同時(shí)，從配方與生產(chǎn)工藝的角度來分析，對含酶洗滌劑進(jìn)行濃縮化工藝升級來提高酶穩(wěn)定性會(huì)越來越得到重視。