姬海剛,楊秀芳,2,惠昱昱,郭林新
(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 西安 710021;2.陜西科技大學(xué) 陜西省輕化工助劑重點(diǎn)實驗室,陜西 西安 710021)
柴胡為傘科植物柴胡(BupleuremChinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleuremscorzonerifoliumWilld)的干燥根,是常用的傳統(tǒng)中藥[1-3],東北和陜西等地是柴胡的主要產(chǎn)區(qū)[4]。柴胡具有疏散退熱和疏肝解郁等功效[5],臨床上用于感冒發(fā)熱癥狀[6]。皂苷是柴胡中的主要生物活性成分之一。但是目前對秦嶺太白山區(qū)柴胡皂苷的提取報道很少。本文采用乙醇加熱回流提取法通過Design-Expert軟件設(shè)計響應(yīng)曲面提取柴胡總皂苷[7],為合理開發(fā)該地區(qū)柴胡的藥用價值提供參考。
柴胡,采自陜西太白山區(qū),經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院康永祥教授鑒定為柴胡 (BupleurumChinenseDC.);香草醛,高純級;柴胡皂苷a,色譜純;乙醇、甲醇、冰乙酸、高氯酸等均為分析純。
723N可見分光光度計;Cary 5000 紫外-可見-近紅外分光光度計;DFY-200C高速萬能粉碎機(jī);DZKW-D-4 電熱恒溫水浴鍋;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
柴胡粉碎過40目篩。稱取適量的柴胡粉末,置于圓底燒瓶,加入濃度70%的乙醇溶液,料液比 1∶20 g/mL,加熱回流,提取3 h。趁熱過濾,收集濾液,減壓回收乙醇,得浸膏。測定柴胡皂苷含量,計算柴胡總皂苷的得率(%)。
柴胡總皂苷得率=(提取液中柴胡皂苷含量×供試品溶液體積)/柴胡質(zhì)量×100%
1.3.1 供試品溶液的制備 定量稱取浸膏,用甲醇定容于50 mL的容量瓶,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品2.4 mg,用甲醇定容于10 mL容量瓶中。
1.3.3 檢測波長的確定 精密移取對照品溶液200 μL,以甲醇為空白對照,水浴揮干溶劑,加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μL,高氯酸800 μL,在60 ℃水浴中放置15 min。取出,用流動水冷卻至室溫,加入冰醋酸5.0 mL,搖勻[8]。在400~800 nm處進(jìn)行紫外掃描,結(jié)果見圖1。
圖1 柴胡總皂苷在不同波長下的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectra of total saikosaponins of BupleurumChinense DC at different wavelengths
由圖1可知,最大吸收波長在610 nm,與鐘巧妮等[9]報道的結(jié)果基本一致。
1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取柴胡皂苷對照品a溶液0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mL,揮干溶劑,按1.2.3節(jié)的顯色方法操作,在波長610 nm處用可見分光光度計測定溶液的吸光度,以溶液的濃度(C)作為橫坐標(biāo),吸光度(A)作為縱坐標(biāo),作圖,得線性回歸方程A=29.667C+0.086 8,R2=0.999 1,線性關(guān)系良好。
不同的提取溶劑對植物不同成分的提取影響較大,提取溶劑與目標(biāo)成分極性相似時,則容易提取目標(biāo)成分[10]。本文從綠色環(huán)保的角度考慮,選擇常用的溶劑乙醇與水作為提取溶劑。乙醇濃度40%,料液比1∶20 mg/L,提取時間60 min,提取溫度 60 ℃,結(jié)果見圖2。
圖2 提取溶劑對總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the yield of total saponins
由圖2可知,用乙醇提取的得率明顯高于水提得率。所以,選擇乙醇作為提取溶劑。
料液比1∶20 mg/L,提取時間60 min,提取溫度60 ℃,乙醇濃度的影響見圖3。
圖3 乙醇濃度對總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total saponins
由圖3可知,當(dāng)乙醇濃度升高時,柴胡總皂苷的得率增加,但當(dāng)乙醇濃度超過70%以后,總皂苷得率開始下降。這是因為由于乙醇濃度的增加,醇溶性雜質(zhì)和色素等成分溶出以及溶液極性的變化導(dǎo)致總皂苷得率下降[11]。因此,選擇70%。
乙醇濃度70%,提取時間60 min,提取溫度 60 ℃,料液比的影響,結(jié)果見圖4。
圖4 料液比對柴胡總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on yield of total saponins
由圖4可知,隨著料液比的增加,柴胡總皂苷的得率上升,當(dāng)料液比<1∶20 g/mL時,上升的趨勢較快,說明在此料液比的范圍內(nèi),增大溶劑的量對總皂苷的得率提升較大。但當(dāng)料液比>1∶20 g/mL時,繼續(xù)增加溶劑的量對總皂苷得率的提升較小。因此,選擇料液比1∶20 g/mL。
乙醇濃度70%,料液比1∶20 g/mL,提取溫度60 ℃,提取時間的影響見圖5。
由圖5可知,延長提取時間,總皂苷得率先增加后降低??傇碥盏寐试?50 min達(dá)到最大值。原因可能是在提取的初始階段,隨著提取時間的增加,有利于皂苷和其它極性化合物的溶解。然而,隨著時間的延長,由于長期處于溫度較高的環(huán)境,柴胡總皂苷部分分解[12]。因此,選擇150 min。
圖5 提取時間對柴胡總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on yield of total saponins
乙醇濃度70%,料液比1∶20 g/mL,提取時間150 min,考察提取溫度對柴胡總皂苷得率的影響,結(jié)果見圖6。
圖6 提取溫度對柴胡總皂苷得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on yield of total saponins
由圖6可知,提取溫度增加,總皂苷得率先增大后減小,提取溫度60 ℃時,總皂苷得率最高。因為隨著溫度的升高,溶劑分子運(yùn)動加快,促進(jìn)溶劑分子更快進(jìn)入柴胡細(xì)胞內(nèi)。所以在60 ℃之前,隨著溫度的升高,溶劑分子運(yùn)動加快,柴胡總皂苷的得率增加。但當(dāng)溫度超過60 ℃時,部分柴胡皂苷在較高溫度下分解,總皂苷得率下降[13]。因此,選擇60 ℃。
在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken進(jìn)行實驗設(shè)計,采用Design-Expert軟件對乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度進(jìn)行優(yōu)化,因素與水平見表1,結(jié)果見表2。
表1 響應(yīng)曲面的因素水平表Table 1 Factor level table of design response surface
表2 響應(yīng)面法實驗結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment
2.6.1 建立回歸方程 上述實驗結(jié)果通過Design-Expert軟件進(jìn)行分析,得回歸方程Y=3.01-0.11A-0.071B-0.027C+0.1D-0.11AB-0.18AC+0.28AD+2.500E-003BC-0.063BD-0.047CD-0.31A2-0.38B2-0.32C2-0.56D2,方差分析結(jié)果見表3。
表3 實驗結(jié)果分析[14]Table 3 Analysis of experimental results
由表3可知,回歸方程的F值為 33.59,平方和為 3.74,自由度為14,均方為0.27,其顯著水平P<0.01,說明該模型非常顯著。
由表3還可知,A、AD、A2、B2、C2、D2對柴胡總皂苷得率的影響較大,達(dá)到極顯著水平(P<0.01),B、D、AB、AC達(dá)到顯著水平(P<0.05),因素C(P=0.313 3>0.05)不顯著。
2.6.2 響應(yīng)曲面分析 將提取時間、提取溫度、乙醇濃度、料液比中任意兩個因素設(shè)為定值時,分析另外兩個因素間的交互作用及對總皂苷得率的影響[15],結(jié)果見圖7。
圖7 各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface of interaction of various factors
2.6.3 工藝條件優(yōu)化 通過優(yōu)化得到的工藝參數(shù):乙醇濃度68.6%,溫度60.58 ℃,提取時間 149.78 min,料液比1∶19.61 g/mL,總皂苷得率3.02%。為簡化工業(yè)化的操作,將工藝參數(shù)調(diào)整為:乙醇濃度69%,溫度61 ℃,提取時間150 min,料液比1∶20 g/mL,并在該條件下進(jìn)行驗證實驗,重復(fù)3次,總皂苷平均得率3.12%,理論值與預(yù)測值相差0.1%。說明該工藝參數(shù)可靠。
用乙醇提取柴胡總皂苷的最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度69%,提取溫度61 ℃,提取時間150 min,提取料液比1∶20 g/mL。在該條件下,柴胡總皂苷的提取率3.12%。