金珊珊，張錦英

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 南京）

0 引言

肺癌是現(xiàn)今最常見的惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率和死亡率都占據(jù)首位且仍在上升[1]。目前，中晚期非小細(xì)胞肺癌主要的臨床治療措施依舊是以化療為主，培美曲塞聯(lián)合鉑類一直是非小細(xì)胞肺癌化療的主要藥物[2]。除此之外，化療聯(lián)合分子靶向藥物的治療也是近些年來惡性腫瘤治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)。其中，羅氏公司研發(fā)的貝伐單抗是較早進(jìn)入臨床應(yīng)用的一個(gè)分子靶向藥物。貝伐單抗能夠特異性的與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF）結(jié)合，使其與受體的相互作用受阻，從而抑制血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少腫瘤新生血管的生成，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[3,4]。

目前，聯(lián)合貝伐單抗的化療方案正越來越多的應(yīng)用于臨床。多項(xiàng)研究證實(shí)，與單純化療相比，貝伐單抗聯(lián)合化療藥物使用具有明顯的協(xié)同作用，可以顯著提高患者的治療有效率及生存期[5]。國內(nèi)外文獻(xiàn)對于貝伐單抗聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌效果的相關(guān)療效已經(jīng)有大量報(bào)道，但對于其對肺癌患者體內(nèi)免疫狀況的研究卻不多見。T 淋巴細(xì)胞亞群正是反應(yīng)人體內(nèi)免疫功能的主要指標(biāo)，可隨著患者病情的改變而發(fā)生變化；調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是目前已知的人體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的免疫抑制細(xì)胞之一，具有負(fù)性調(diào)控的作用，能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和生長[6-8]。根據(jù)目前對腫瘤免疫的研究表明，在腫瘤患者體內(nèi)往往存在著效應(yīng)T 細(xì)胞被抑制及Treg 細(xì)胞高表達(dá)的紊亂狀態(tài)[9]。因此，本研究對貝伐單抗聯(lián)合化療治療的中晚期非小細(xì)胞肺癌患者外周血中的T 淋巴細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)比例進(jìn)行檢測，分析其中的關(guān)聯(lián)，探討貝伐單抗對他們表達(dá)水平的影響及其與非小細(xì)胞肺癌療效和預(yù)后的關(guān)系，為以含貝伐單抗的治療方案對肺腺癌患者的臨床療效評價(jià)和預(yù)后提供幫助。

1 對象與方法

1.1 病例選擇與一般資料

選擇2014年1月至2020年1月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科就診的中晚期非小細(xì)胞肺癌患者50 例，按照治療方式的不同將所有患者分為對照組和觀察組。對照組25 例，男性13 例，女性12 例；年齡29～75 歲，平均年齡（57.8±12.8）歲，均接受培美曲塞加鉑類化療(500mg/m2d1+75mg/m2）。觀察組25 例，男性15 例，女性10 例；年齡30～76 歲，平均年齡（57.3±9.3）歲，均接受貝伐單抗聯(lián)合培美曲塞加鉑類治療，貝伐單抗的用量為7.5mg/kg。比較兩組患者的一般資料，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。全部的病例均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌，預(yù)計(jì)生存期不低于3 個(gè)月，患者均經(jīng)影像學(xué)證實(shí)，有可客觀評價(jià)的靶病灶。

1.2 檢測方法

所有肺癌患者用EDTA-二鉀抗凝真空采血管在治療前三天內(nèi)及治療4 周期結(jié)束分別抽取外周血2 mL，采用BD 公司的CD4/CD8/CD3 FITC/PE/PC5/ 三色標(biāo)記的抗體，CD3/CD16+56 FITC/PE 雙 標(biāo) 記 的 抗 體 及 CD4/FITC、CD127/PE、CD25/PC5 標(biāo)記的抗體， 利用FC500 流式細(xì)胞儀檢測T 淋巴細(xì)胞亞群及Treg 細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo)

每位患者每治療2 個(gè)周期進(jìn)行1 次影像學(xué)檢查以評價(jià)療效，至少完成4 個(gè)周期的治療。檢測患者治療前三天內(nèi)及治療4 周期結(jié)束后外周血中T 淋巴細(xì)胞亞群、Treg 細(xì)胞的比例，分析其與患者臨床特征的關(guān)系。

臨床療效按照實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)[10]進(jìn)行，分為CR(完全緩解):所有病灶消失；PR(部分緩解):治療開始后記錄到的最小靶病灶長徑總和縮小≤30%；SD (疾病穩(wěn)定):基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR 或有增加但未達(dá)PD；PD (病情進(jìn)展):基線病灶長徑總和增加≥20% 或出現(xiàn)新病灶。以CR+PR 例數(shù)占每組患者總數(shù)的百分率為客觀有效率(ORR)，以CR+PR+SD 例數(shù)占每組患者總數(shù)的百分率為疾病控制率(DCR)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行治療前后組內(nèi)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析，相關(guān)性分析采用 Pearson 相關(guān)性分析,以P＜0.05 時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體療效

兩組患者均完成4 個(gè)治療周期, 可以評價(jià)其臨床療效。根據(jù)療效評價(jià)，觀察組無CR，PR1 例，SD23 例，PD1 例，客觀有效率ORR 為4%,疾病控制率DCR 為96%；對照組無CR，PR1 例，SD17 例，PD7 例，客觀有效率ORR 為4%,疾病控制率DCR 為72%。見表1。

表1 兩組患者總體療效分析

2.2 兩組患者治療前后免疫功能的分析

治療前，比較兩組CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.79,P=0.29,P=0.13，P=0.6);治療后，兩組CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞均明顯高于同組治療前，Treg 細(xì)胞明顯低于同組治療前(P均＜0.05),兩組CD8+T 細(xì)胞較之前有所下降，但是下降并不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.18,P=0.14）；貝伐單抗觀察組CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞相比對照組均顯著提高， Treg 細(xì)胞相比對照組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者治療前后免疫功能的分析

2.3 兩組患者治療前后外周血 CD3+T 細(xì)胞 與 Treg 細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性分析

對50 例肺癌患者治療前后外周血中CD3+T 細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者之間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.36, r=-0.58,P均＜0.05)。見圖1，2。

圖1 治療前外周血CD3+T 細(xì)胞與Treg 的相關(guān)性分析

2.4 不良反應(yīng)

貝伐單抗聯(lián)合培美曲塞加鉑類治療患者均無因發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)而停止治療的病例?；颊咴谥委熯^程中的不良反應(yīng)較輕，均能很好耐受。主要的不良反應(yīng)為高血壓和蛋白尿，伴隨著一些輕度的惡心嘔吐、腹瀉、中性粒細(xì)胞下降、血小板減少和肝損害等，這些不良反應(yīng)往往較輕微，經(jīng)過相應(yīng)的對癥處理后均能有效緩解，不影響患者的繼續(xù)治療。

圖2 治療后外周血CD3+T 細(xì)胞與Treg 的相關(guān)性分析

3 討論

肺癌目前的發(fā)病率呈顯著增長的趨勢，中國大部分的中晚期肺腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)無法進(jìn)行手術(shù)切除，因此目前治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的主要臨床措施還是以化療為主的內(nèi)科綜合治療。培美曲塞聯(lián)合鉑類的化療方案雖然被證明對中晚期非小細(xì)胞肺癌有效且相對安全，但近年來總體生存率未見明顯改善[11]。因此，臨床上需要一類藥物，可以顯著提升中晚期肺癌的療效，以及提高患者的生活質(zhì)量并延緩其生命。目前的研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，VEGF 參與了腫瘤組織微血管的形成，中晚期非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生機(jī)制也可能與VEGF 及其受體有關(guān)[12]。因此，抑制VEGF 的表達(dá)，有利于抑制腫瘤的生成和發(fā)展[13]。貝伐單抗是世界上第一個(gè)抗腫瘤血管生成的分子靶向藥物，對腫瘤新生血管具有明顯的抑制作用，能夠促進(jìn)腫瘤組織的萎縮凋亡。此外貝伐單抗能夠改善腫瘤血管的通透性，進(jìn)而改善腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)化療藥物更有效的作用于瘤體，抑制腫瘤的發(fā)展[14]。

隨著對腫瘤免疫的不斷深入研究，我們發(fā)現(xiàn)肺癌患者的免疫狀態(tài)均存在不同程度的改變，常規(guī)的放化療亦會加重機(jī)體的負(fù)擔(dān)使其免疫功能低下[15]，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展同時(shí)又與患者的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。在機(jī)體抗腫瘤免疫中主要以T 淋巴細(xì)胞較為關(guān)鍵，T 淋巴細(xì)胞亞群也是反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，T 淋巴細(xì)胞的減少可以引起機(jī)體抗腫瘤免疫功能降低[16,17]。另外，Treg 這類具有負(fù)向調(diào)控作用的細(xì)胞在導(dǎo)致肺癌患者免疫功能紊亂中也扮演著重要角色，它的含量與肺癌的生成與發(fā)展、治療與預(yù)后也明顯相關(guān)[18]。研究表明，Treg 細(xì)胞是目前已知的人體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的免疫抑制細(xì)胞之一，可以分泌多種具有抑制性的細(xì)胞因子，如IL- 4、IL-10 和TGF-β，從而抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的活化；可以通過干擾免疫細(xì)胞的正常代謝來抑制機(jī)體的免疫功能[19,20]。隨著研究的深入，顯示出Treg 細(xì)胞不僅能夠抑制CD3+T 細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，還能夠抑制NK 細(xì)胞。在腫瘤患者的外周血中，Treg 細(xì)胞的表達(dá)比例顯著升高，數(shù)量明顯增多，且通常與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性[21-23]。因此檢測T 淋巴細(xì)胞亞群及Treg 細(xì)胞的表達(dá)比例能夠反映肺癌患者免疫狀態(tài)及治療效果[24,25]。

本研究以中晚期非小細(xì)胞肺癌患者為研究對象，探討貝伐單抗聯(lián)合化療治療肺癌患者的臨床效果及對T 淋巴細(xì)胞亞群和Treg 細(xì)胞的影響，以期為中晚期肺癌的治療和預(yù)后探討更優(yōu)途徑。在本研究中，觀察組的客觀有效率和疾病控制率分別為4%和96%，顯著高于對照組的4%和72%，說明培美曲塞聯(lián)合鉑類化療的方案雖然對肺癌患者有一定的效果，但是貝伐單抗聯(lián)合化療的療效明顯優(yōu)于單純化療，這與之前的一些研究報(bào)道基本一致[26]。兩組患者在接受4 個(gè)周期的治療后，外周血中CD3+、CD4+T 細(xì)胞的比例均較治療前有明顯的提升，CD8+T 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的比例也比治療前顯著下降，說明治療前肺癌患者的免疫功能處于被抑制的狀態(tài)。在接受了治療后，患者的免疫功能有所好轉(zhuǎn)，腫瘤的生長也被抑制。在治療后，觀察組患者的CD3+、CD4+T 細(xì)胞比對照組也有明顯的提高，Treg 細(xì)胞明顯降低，說明雖然兩種治療方法均能提升患者的免疫能力，延緩腫瘤的發(fā)展，但是貝伐單抗聯(lián)合化療比單純的化療對于患者免疫功能的恢復(fù)和提高更加明顯，對腫瘤的抑制效果也更加明顯。結(jié)合兩組患者治療效果，提示外周血中 T 淋巴細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的水平可隨著患者病情的改變而發(fā)生變化，通過檢測其水平能夠有效預(yù)測患者的療效和預(yù)后情況。在本研究中，同時(shí)將兩組患者在治療前后的CD3+T 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)性分析。顯示在治療前后，CD3+T 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞二者的比例均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系。既往有研究指出T 淋巴細(xì)胞水平和腫瘤進(jìn)展有著密切聯(lián)系。T 淋巴細(xì)胞不僅能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過激活免疫系統(tǒng)的其他成分來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。機(jī)體正常狀態(tài)下Treg 細(xì)胞的表達(dá)比例較低，惡性腫瘤細(xì)胞能夠激活Treg 細(xì)胞，促使他們通過不同的機(jī)制激活和擴(kuò)增，成為具有免疫抑制功能的細(xì)胞，進(jìn)而抑制免疫系統(tǒng)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[27]。肺癌患者在接受治療前外周血中Treg 細(xì)胞的表達(dá)比例明顯升高并抑制CD3+T 細(xì)胞的表達(dá)，在接受治療后，隨著Treg 細(xì)胞比例的下降，CD3+T 細(xì)胞呈顯著的上升趨勢，且接受貝伐單抗聯(lián)合治療的患者外周血中Treg 細(xì)胞的降低幅度及CD3+T 細(xì)胞的上升幅度均遠(yuǎn)高于單純化療組的患者。顯示出貝伐單抗具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力，能夠抑制肺癌患者體內(nèi)的Treg 細(xì)胞，有效調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，提高T 淋巴細(xì)胞的水平，最終改善腫瘤患者的免疫功能。同時(shí)，本研究也證實(shí)了外周血中Treg細(xì)胞的比例與患者的療效和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性，有效抑制肺癌患者體內(nèi)Treg 細(xì)胞的表達(dá)量將有助于提高肺癌的治療效果。

綜上所述，T 淋巴細(xì)胞及Treg 細(xì)胞的狀態(tài)可以反映機(jī)體的抗腫瘤免疫水平，檢測外周血中T 淋巴細(xì)胞及Treg 細(xì)胞的表達(dá)水平有助于評估療效，判斷預(yù)后。結(jié)合本次的研究結(jié)果，可以推測出貝伐單抗聯(lián)合化療可以提升中晚期非小細(xì)胞肺癌患者的免疫功能，增強(qiáng)肺癌的治療效果，其治療效果一定程度上可以通過監(jiān)測T 淋巴細(xì)胞及Treg 細(xì)胞的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。但本研究的樣本量較小，后期可能需要更多樣本進(jìn)一步證實(shí)貝伐單抗在臨床用藥中的優(yōu)勢。