許凱強，尚忠明，王寓平，劉勇

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院普通外科（血管外科），四川 瀘州；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院血管甲狀腺乳腺外科，四川 瀘州）

0 引言

糖尿病在全世界范圍已經(jīng)變得越來越流行，中國也逐漸成為了糖尿病大國。當糖尿病合并動脈鈣化時心血管疾病發(fā)生的危險性也增加了2-4 倍。其成為了糖尿病患者死亡的首要原因[1]。血管鈣化是普遍存在于動脈粥樣硬化、糖尿病周圍血管病變、血管損傷、收縮性高血壓等疾病中的共同的病理表現(xiàn)[2]。其形成的早期過程是一個與骨發(fā)育相似的主動的、可調(diào)控的生物學過程。血管壁細胞尤其是平滑肌細胞在某些誘導(dǎo)條件下從原來的收縮樣表型向成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致血管鈣化。

而Wnt/β-catenin 信號通路是骨形成過程中最關(guān)鍵的信號通路。表型轉(zhuǎn)化后的平滑肌細胞具有成骨樣細胞特點：即質(zhì)膜上都表達Runx2、OPG、ALP、分泌Ⅰ型膠原、OPN、骨鈣蛋白和骨連蛋白等，而這些蛋白均受Wnt/β-catenin 信號的調(diào)控。在經(jīng)典的Wnt/β-catenin 途徑中，Wnt 蛋白通過結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)pro-TIN5/6（LRP5/6）共受體和膜卷曲G 蛋白偶聯(lián)受體的受體復(fù)合物（FGRs）來發(fā)揮作用。一旦與其受體/ 共受體偶聯(lián)，Wnt 便引起下游信號事件，導(dǎo)致β-catenin 的脫磷酸化和穩(wěn)定化，導(dǎo)致β-catenin 易位進入細胞核，與DNA 結(jié)合配偶體即T 細胞相互作用因子（TCF）/淋巴增強結(jié)合因子（LEF）相互作用，以啟動 Wnt 靶向基因的轉(zhuǎn)錄[3]。在Wnt/β-catenin 信號通路中，抑制糖原合成酶激酶3（GSK3），使Ser33/Ser37/Thr41 位 點 的β-catenin 磷 酸化降低，降解降低，穩(wěn)定性增加。同時, 蛋白激酶 A（PKA）或 p21 活化激酶 1（PAK1）對Ser675 位點的β-catenin 磷酸化也導(dǎo)致β-catenin 活化[4]。此外，據(jù)K.I.Bostrom 等[5]人研究表明,Wnt/β-catenin 信號是多能間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化所必需的。有望通過原始成骨因子激活Wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致 Runx2 表達的上調(diào)，從而來調(diào)節(jié)成骨相關(guān)蛋白的表達和調(diào)節(jié)成骨細胞分化。本實驗研究高脂飼料（HFD）+VicD3 肌肉注射+腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建的2 型糖尿病合并血管鈣化模型中，運用PI3K/AKT GSK-3β 信號通路抑制劑（LY294002 和 TWS119）驗證晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）以及 PI3K/AKT GSK-3β 信號通路與糖尿病動脈血管鈣化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

西南醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供的平均月齡2月的，體重在100±20g 的SD(Sprague-Dawley)大鼠60 只。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學忠山校區(qū)動物房。

1.2 主要試劑

一抗Runx2、OPG、BMP2 及兔抗人 AKT、 GSK 單克隆抗體一抗及β-catenin 單克隆抗體一抗購自美國CST 公司；二抗購自武漢碧云天公司；石蠟切片Von kossa 鈣染色試劑盒、組織鈣離子測定試劑盒購自上海杰美基因公司；彈性纖維染色試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma 公司；大鼠AGEs酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購自武漢華美公司。

1.3 動物分組及模型建立

分組：將全部大鼠隨機分為空白對照組、DM 組、DM+DMSO 組、LY294002 組、TWS119 組，每組各12 只 SD 大鼠。N 組用普通飼料喂養(yǎng)4 周，DM 組、 DMSO 組、LY294002組、TWS119 組用高脂高糖高膽固醇模型飼料（HFD）飼養(yǎng)4周+維生素 D3 肌肉注射+尼古丁灌胃。4 周后測空腹血糖（記錄為0 天）。 DM 組、DMSO 組、LY294002 組、TWS119 組腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）構(gòu)建糖尿病合并血管鈣化大鼠模型。腹腔注射STZ 后的第3、5、7、14、28 天，連續(xù)監(jiān)測隨機空腹血糖，糖尿病模型未成功的大鼠再予以少劑量 STZ 腹腔追加注射。

1.4 PI3K/AKT GSK-3β 信號通路的抑制劑注射

N 組大鼠予以10mL/kg 生理鹽水腹腔注射；DM 組大鼠同樣予以10mL/kg 生理鹽水腹腔注射；DMSO 組大鼠予以10mL/kg 二甲基亞砜（DMSO）腹腔注射； LY294002 組大鼠予以AKT 抑制劑LY294002 按照60mg/kg 劑量腹腔注射，每天下午注射，持續(xù)3 周；TWS119 組大鼠予以GSK-3β 抑制劑TWS119 按照30mg/kg 的劑量腹腔注射，同樣每天下午注射，持續(xù)3 周。

1.5 大鼠血清晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

將事先備用的已離心血清，室溫下復(fù)溫后，用臺式高速離心機以3000×g,4℃的條件離心10min,再取上清液進行標準品的稀釋與加樣后，置37℃溫育 30 分鐘，再配液及洗滌5 次后加入酶標試劑50μl，再次溫育及洗滌后，加入顯色劑A、B各50μl，置37℃避光顯色15 分鐘后，以450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。

1.6 大鼠動脈血管組織鈣含量的測定

取出大鼠動脈標本，用GENMED 清理液中清洗后置于液氮中過夜。第二天用缽杵碾碎組織至粉末狀態(tài)。磨好后置于EP 管中，加入200μlGENMED 裂解液，混勻，充分裂解。裂解好后進行離心處理（12000rpm，10min），取上清液后分裝與EP 管中。分別將去離子水10μl 加入1mmol/L 的鈣標準液10μl 加入標準孔，樣本上清液10μl 加入測定孔。最后再分別向空白孔、標準孔和測定孔加入工作液Ⅰ250μl?；靹颍o置5 分鐘后，波長610nm，酶標儀比色，測各孔OD 值。

1.7 大鼠動脈血管石蠟切片的彈性纖維染色

將載玻片脫蠟后；放置彈性染色溶液中染色10 分鐘；離子水沖洗后，用工作氯化鐵溶液分化；再用自來水沖洗后行顯微鏡檢查；然后酒精去碘、離子水沖洗后在 Van Gieson Solution 工作液中染色1-3 分鐘，并用水化二甲苯或二甲苯替代品脫水固定后行一般光學顯微鏡下觀察照相。

1.8 大鼠動脈血管石蠟切片的Von kossa（馮庫薩）染色

常規(guī)石蠟處理后，加上100μl GENMED 染色液（Reagent G）置于太陽光直射或60 瓦燈直射孵育60 分。移去GENMED 染色液后，置入50mL GENMED 清理液（Reagent F）中孵育2 分鐘移去GENMED 清理液后，再行復(fù)染處理，最后用一般光學顯微鏡下觀察并照相：鈣沉積陽性細胞呈現(xiàn)黑色。

1.9 Western Blot 分析

將血管組織塊清洗研磨后，迅速轉(zhuǎn)移至2mL EP 管中。加入10 倍于組織體積的組織蛋白提取試劑，冰浴徹底勻漿，再用超聲儀破碎。采用離心法（4℃12000rpm）離心5 分鐘，收集上清，即為總蛋白溶液。然后使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度后。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)，采用半干式電轉(zhuǎn)移將蛋白分子轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF 膜放入封閉液中封閉2 小時后，用TBST 溶液清洗PVD,膜15 分鐘，隨后將其放入一抗的孵育盒中在冰箱4℃搖床過夜。第二天回收稀釋一抗，再取出PVDF 膜，用TBST 多次清洗(5-10min/次)，然后放入二抗的孵育盒中，孵育2 小時后用TBST 再次多次清洗(5-10min/次)。然后放入凝膠成像系統(tǒng)中，暗室中曝光成像。根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件，多次顯影、定影。

1.10 統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0 進行統(tǒng)計學分析。采用方差分析，所有結(jié)果用 mean±SD 表示，兩組獨立樣本的比較采用t檢驗法，P＜0.05 和P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖測定

實驗組（包括DM 組、DMSO 組、LY294002 組、TWS119組48 只）大鼠按照50mg/kg STZ 腹腔注射1% STZ 溶液，對照組（12 只）大鼠按照等劑量檸檬酸鹽緩沖溶液腹腔注射。在STZ 溶液注射后的第3、5、7、14、28 天隨機檢測大鼠空腹血糖。在高脂飼料飼養(yǎng)4 周過程中，組2（DM 組）中有1 只大鼠因與組內(nèi)其他大鼠相互撕咬而死亡。在STZ 溶液注射以后第3 天和第5 天，總計共6 只大鼠空腹血糖水平＜16.6mmL/L。追加腹腔小劑量注射STZ 后，這6 只大鼠空腹血糖水平穩(wěn)定，且均＞16.6mmL/L，造模成功。在STZ 溶液注射以后28 天內(nèi)，總計共4 只大鼠因血糖波動過大、糖尿病并發(fā)感染或者不進飲食而死亡。另外有1 只大鼠因多次檢測空腹血糖均＜16.6mmL/L，且追加腹腔小劑量注射STZ 后仍未造模成功，故予以排除。糖尿病大鼠模型成模率87.5%，失敗率為12.5%。大鼠空腹血糖統(tǒng)計結(jié)果見圖1。

2.2 大鼠血清AGEs 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

圖2 為通過ELISA 試劑盒檢測大鼠血清中的AGEs 含量。與對照組相比較，DM 和DM+DMSO 組大鼠血清中的AGEs 含量明顯增高；DM 組與DM+DMSO 組兩者之間，大鼠血清中的AGEs 含量沒有明顯差異；在運用AKT 通路抑制劑LY294002 后，LY294002 組大鼠血清中的AGEs 含量明顯下降；在運用GSK 通路抑制劑TWS119 后，TWS119 組大鼠血清中的AGEs 含量明顯增高。由此可見，大鼠血清中的AGEs含量與大鼠血管鈣化程度存在某種一致性。

2.3 大鼠動脈血管組織鈣含量的測定

圖3 為大鼠動脈血管組織鈣含量的測定。該實驗檢測結(jié)果可以直接反應(yīng)出大鼠動脈血管組織中的鈣含量，可以比較直觀地反應(yīng)各組之間血管的鈣含量與血管鈣化之間的關(guān)系。

圖1 大鼠空腹血糖測定

圖2 大鼠血清AGEs 含量測定

大鼠血清AGEs 的含量分組 N 組 DM 組 DMSO 組 LY 組 TWS 組大鼠血清AGEs 含量（ng/L） 36.46±2.11 51.37±0.91# 49.82±0.98# 32.01±1.25** 6.29±0.99*大鼠動脈組織鈣定量檢測分組 N 組 DM 組 DMSO 組 LY 組 TWS 組動脈組織鈣定量（mmol/L） 6.85±0.57 14.23±1.62# 12.50±1.49# 7.39±0.64** 16.02±1.58*

圖3 為大鼠主動脈組織鈣含量測定

2.4 大鼠動脈血管石蠟切片的免疫組化檢測β-catenin的表達

N 組大鼠血管未見明顯β-catenin 表達；DM 組大鼠血管可見明顯β-catenin 表達，說明糖尿病鈣化模型大鼠體內(nèi)的某種物質(zhì)可以促進β-catenin 表達的上調(diào)；DMSO 組大鼠血管同樣可見明顯β-catenin 表達，說明DMSO（二甲基亞砜）溶液對β-catenin 的表達沒有明顯影響；與DM 組大鼠相比較，LY294002 組大鼠血管可見少許β-catenin 表達，說明AKT 通路抑制劑LY294002 能夠降低β-catenin 的表達，并且通過降低β-catenin 的表達來抑制血管鈣化；與DM 組大鼠相比較，TWS119 組大鼠血管可見明顯β-catenin 表達，說明GSK 通路抑制劑TWS119 能夠上調(diào)β-catenin 的表達，并且通過上調(diào)β-catenin 的表達來促進血管鈣化，如圖4。

圖4 大鼠動脈血管石蠟切片的免疫組化檢測β-catenin 的表達

2.5 大鼠動脈血管石蠟切片的彈性纖維染色

圖5 為大鼠主動脈石蠟切片的彈性纖維染色結(jié)果。圖中紅色為膠原纖維，黑色波浪狀條紋為彈性纖維。N 組大鼠可見許多連續(xù)的彈性纖維表達，紅色膠原纖維表達較少；與N組大鼠相比較，DM 組大鼠彈性纖維斷裂，受到破壞，而紅色膠原纖維的表達有所增加；DOSO 組大鼠彈性纖維與DM 組比較，兩者未見明顯差異，均可見彈性纖維的斷裂或表達減弱，而紅色膠原纖維的表達有所增加；與DM 組大鼠相比較，LY294002 組大鼠彈性纖維斷裂減少，完整性增加，而紅色膠原纖維表達較少；與DM 組大鼠相比較，TWS119 組大鼠彈性纖維斷裂增加，完整性減少，彈性纖維的表達減弱，而紅色膠原纖維的表達相應(yīng)地有所增加。

圖5 大鼠主動脈石蠟切片的彈性纖維染色結(jié)果

2.6 大鼠動脈血管石蠟切片的Von kossa（馮庫薩）染色

圖6 為大鼠動脈血管石蠟切片的Von kossa（馮庫薩）染色。圖中血管內(nèi)膜及中膜鈣化明顯處（黑色區(qū)域）均表現(xiàn)為黑色鈣鹽沉積，如圖中尖頭所指。N 組大鼠血管動脈未見明顯鈣鹽沉積，血管內(nèi)膜較為完整；與N 組大鼠相比，DM 組和DMSO 組大鼠動脈血管鈣化明顯，說明高脂飼料飼養(yǎng)+維生素D3 肌注+尼古丁灌胃造模的糖尿病血管鈣化大鼠血管鈣化明顯，且DMSO（二甲基亞砜）溶液對大鼠動脈血管的鈣化沒有明顯影響；與DM 組大鼠相比，LY294002 組大鼠動脈血管鈣化表達受到抑制，說明AKT 通路抑制劑LY294002 能夠減輕血管的鈣化；與DM 組大鼠相比，TWS119 組大鼠動脈血管鈣化表達增強，可見明顯黑色鈣鹽沉積，說明GSK 通路抑制劑TWS119 能夠加重血管的鈣化。

圖6 大鼠動脈血管石蠟切片的Von kossa（馮庫薩）染色

2.7 Western Blot 蛋白印跡檢測

圖7A 蛋白印跡示AKT 的表達：如圖所示，總AKT 的表達在N 組、DM 組、DMSO 組、LY294002 組四組之間沒有明顯差異；作為AKT 蛋白活性形式的P-AKT，在N 組中沒有明顯表達；與N 組相比，P-AKT 在DM 組和DMSO 組中的表達升高；與DM 組相比，在加入了AKT 通路抑制劑LY294002 后，P-AKT 的表達受到了抑制。

圖7 A 為Western Blot 蛋白印跡檢測通路蛋白AKT 的表達

圖7B 蛋白印跡示GSK3β 的表達：如圖所示，總GSK3β的 表 達 在N 組、DM 組、DMSO 組、LY294002 組、TWS119 組五組之間差異較??；作為GSK3β 蛋白活性形式的P-GSK3β，在N 組中沒有明顯表達；與N 組相比，DM 組和DMSO 組中P-GSK3β 的表達升高；與DM 組相比，在加入了AKT 通路抑制劑LY294002 后，P-GSK3β 的表達下降。而與DM 組相比，在加入了GSK3β 通路抑制劑TWS119 后，P-GSK3β 的表達增加。

圖7 B 為Western Blot 蛋白印跡檢測通路蛋白GSK3β 的表達。

圖7C 在免疫組化檢測β-catenin 的表達后，圖7C 為Western Blot 蛋白印跡進一步檢測β-catenin 蛋白的表達：如圖所示，在N 組中，β-catenin 幾乎沒有表達；與N 組相比，DM 組和DMSO 組中，β-catenin 的表達有所升高；與DM 組相比，在加入了AKT 通路抑制劑LY294002 后，β-catenin 的表達受到了抑制；與DM 組相比，在加入了GSK3β 通路抑制劑TWS119 后，β-catenin 的表達上調(diào)。

圖7 C 為Western Blot 蛋白印跡檢測通路蛋白β-catenin 的表達

圖7D 蛋白印跡示成骨相關(guān)蛋白的表達：如圖所示，在N組中，成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPG 及BMP2 幾乎沒有表達；與N 組比較，DM 組和DMSO 組中，成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPG及BMP2 的表達有所升高；與DM 組相比，在加入了AKT 通路抑制劑LY294002 后，成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPG 及BMP2 的表達受到了抑制；與DM 組相比，在加入了GSK3β 通路抑制劑TWS119 后，成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPG 及BMP2 的表達上調(diào)。

圖7 D 為Western Blot 蛋白印跡檢測成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPG 及BMP2 的表達

3 討論

血管鈣化大多是血管壁中以羥磷灰石的形式存在的礦物硫酸鈣的沉積。血管鈣化是許多疾病的一個共同的顯著特點，這些疾病包括動脈粥樣硬化，糖尿病，慢性腎臟疾病等。在越來越多的國家，血管鈣化逐漸成為心腦血管疾病發(fā)病率和致死率的一個強有力的預(yù)測指標[2]。而血管平滑肌細胞目前被認為是主要負責血管鈣化的細胞，來自平滑肌細胞的凋亡小體能作為鈣晶體形成的成核結(jié)構(gòu)來啟動血管鈣化[6]。血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）可以進行成骨分化和表達成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2 和其他骨形成相關(guān)蛋白，比如I 型膠原蛋白(Col I),堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素等，這些蛋白導(dǎo)致了磷酸鈣在細胞外基質(zhì)的沉積。而這些成骨相關(guān)蛋白均受而AKT/GSK-3β-Wnt/β-catenin 信號通路的調(diào)控。只有少數(shù)學者闡述了Wnt/β-catenin 信號通路的一些目標點之間的關(guān)系，例如LRP5 和血管平滑肌鈣化之間的關(guān)系[7]。在Rajamannan NM 等人的研究中，也證明了血管平滑肌的鈣化發(fā)生常伴隨GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達的上調(diào)，而兩者均是Wnt /β-catenin 信號通路的關(guān)鍵目標點[8]。

（1）AGEs 與動脈血管鈣化

糖尿病是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要危險因素之一。在糖尿病患者中，血糖的升高和血漿中的蛋白質(zhì)、氨基和酸肽的游離氨基末端的增多，通過非酶糖基化，最終形成AGEs（Advanced glycation endproducts，晚期糖基化終末產(chǎn)物）[9]。

在本實驗中，我們通過高脂飼料喂養(yǎng)+腹腔注射STZ 造大鼠Ⅱ型糖尿病模型，模擬臨床中常見的糖尿病患者的體內(nèi)情況。通過ELISA 試劑盒檢測血清中的AGEs 濃度中，我們發(fā)現(xiàn)，和N 組比較，DM 組大鼠血清中的AGEs 濃度明顯增高，證實了AGEs 的產(chǎn)生和血糖的升高和血漿中的蛋白質(zhì)、氨基和酸肽的游離氨基末端的增多可能存在著密切聯(lián)系。而且在DM 組，DMSO 組以及TWS119 組中，血清中AGEs 的高表達和成骨相關(guān)蛋白Runx2，OPG，BMP 等的高表達以及β-catenin蛋白的高表達呈現(xiàn)高度一致性也許能印證AGEs 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進成骨相關(guān)蛋白的形成觀點。

（2）PI3K/AKT 與動脈血管鈣化

PI3K/AKT 信號通路廣泛存在于各種細胞中，是參與細胞增殖、分化和生長的重要信號傳導(dǎo)通路。AKT 是PI3K 的下游效應(yīng)子，PI3K 激活A(yù)KT 后使AKT 的Ser473 和Thr308 位點磷酸化，從而激活A(yù)KT。AKT 是一種S/T 激酶，在參與細胞生長調(diào)節(jié)的許多關(guān)鍵蛋白激活生長因子時，PI3K/PTEN/AKT/mTORC1，Ras/Raf/MEK/ERK 和其他途徑同時也被激活[10]。在本實驗中，我們運用AKT 的抑制劑LY294002 處理糖尿病大鼠，我們發(fā)現(xiàn)：P-AKT 在N 組中沒有明顯表達；與N 組相比，P-AKT 在DM 組和DMSO 組中的表達升高，我們猜測P-AKT表達的增加與大鼠糖尿病有著某種聯(lián)系；DM 組和DMSO 組差異沒有統(tǒng)計學意義，說明作為LY294002 的溶劑的DMSO對P-AKT 的表達沒有影響；與DM 組相比，在加入了AKT 通路抑制劑LY294002 后，P-AKT 的表達受到了抑制。

（3）GSK-3β 與動脈血管鈣化

GSK-3β 是 腺 瘤 性 大 腸 桿 菌/axin/GSK-3β 復(fù) 合 物 的組分部分，參與β-catenin 的泛素化和蛋白酶體的降解，而β-catenin 是Wnt /β-catenin 信 號 通 路 的 關(guān) 鍵 分 子[11]。TWS119 是GSK-3β 的抑制劑,在無細胞試驗中IC50（半抑制濃度）為30nM，能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的分化并且有助于干細胞生物學的研究。

在本實驗中，我們運用GSK 的抑制劑TWS119 處理糖尿病大鼠，我們發(fā)現(xiàn)：在彈性纖維染色中，與DM 組大鼠相比較，TWS119 組大鼠彈性纖維斷裂增加，完整性減少，彈性纖維的表達減弱，而紅色膠原纖維的表達相應(yīng)地有所增加。在免疫組化測定β-catenin 的表達中，TWS119 組大鼠血管可見明顯β-catenin 表達。在成骨相關(guān)蛋白的表達中，TWS119組Runx2、OPG 及BMP2 的表達均上調(diào)。因此，我們驗證了TWS119 可能是通過抑制GSK-3β 來抑制β-catenin 的降解，理論上激活Wnt /β-catenin 信號通路,從而引起糖尿病血管中膜的鈣化。

(4)Wnt/β-catenin 與動脈血管鈣化

Wnt/β-catenin 信號通過在骨祖細胞中促進Runx2 的表達從而在骨形成中發(fā)揮著重要作用。然而，Wnt/β-catenin 信號對Runx2 的調(diào)控和在血管平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化中的作用尚未被完全闡明。Ting Cai 等[12]人的研究對該機制作用做了以下研究。首先，Wnt/β-catenin 信號誘導(dǎo)Runx2表達，并通過高磷酸激活β-catenin，并且通過過表達穩(wěn)定的β-catenin 或 通 過 抑 制GSK-3β 的 信 號 傳 導(dǎo) 在VSMCs 中誘導(dǎo)Runx2 表達。第二，Runx2 基因啟動子區(qū)域包含兩個TBE（功能性T 細胞因子/ 淋巴增強子結(jié)合位點），其功能性介導(dǎo)與功能性T 細胞因子相互作用以響應(yīng)β-catenin 活化。第三，通過Wnt-3a 激活β-catenin 誘導(dǎo)Runx2 表達，而PORCN 抑制劑或DKK1 通過抑制Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)來減弱VSMCs 中高磷酸激酶刺激的Runx2 誘導(dǎo)。第四，Wnt-3a 上調(diào)骨鈣素OPG 表達，促進血管平滑肌細胞鈣沉積，而DKK1 可抑制高磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化。最后，β-catenin被激活，Runx2 在主動脈中膜被誘導(dǎo)，其次是內(nèi)膜，Runx2 mRNA 水平與主動脈壁中活性β-catenin 的表達呈正相關(guān)。鑒于高磷酸鹽激活VSMCs 中的β-catenin，該信號通路可能在介導(dǎo)高磷酸鹽觸發(fā)的Runx2 誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。因此，這些結(jié)果表明，Runx2 誘導(dǎo)可以在介導(dǎo)Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)促進血管鈣化的作用中發(fā)揮重要作用。

Runx2 被誘導(dǎo)，β-catenin 被血管平滑肌細胞（VSMCs）中的高磷酸激活。兩種活性形式的β-catenin 在Ser37/Thr41 上去磷酸化并在Ser675 位點磷酸化，通過高磷酸鹽，兩者活性都被上調(diào)。β-catenin 的活化，通過異常表達穩(wěn)定的β-catenin，抑制GSK3β 或Wnt3a 蛋白，誘導(dǎo)Runx2 表達，而用Dickkopf-1 通過阻斷Wnt/β-catenin 信號來抑制Runx2 誘導(dǎo)高磷酸鹽。Wnt3a 可促進血管平滑肌細胞的骨鈣素表達和鈣沉積，而DKK1 可以改善由高磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMCs 的鈣化。在VSMCs 中Runx2 基因的啟動子區(qū)域中鑒定出兩個功能性T 細胞因子/淋巴增強子結(jié)合位點，它們與β-catenin 相互結(jié)合相互作用。它們各自的定點突變減弱了Runx2 對β-catenin的反應(yīng)。高磷酸鹽可以通過不同的途徑激活Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，通過直接下游靶標Runx2 激活的Wnt/β-catenin信號可以促進血管平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化。已經(jīng)證明VSMCs 暴露于高磷酸鹽環(huán)境，類似于糖尿病患者的病理生理狀態(tài)，以啟動血管平滑肌細胞向成骨細胞樣細胞的分化，并執(zhí)行調(diào)節(jié)骨基質(zhì)沉積過程的細胞程序[13]。

Runx2 和Wnt/β-catenin 對于骨形成和骨重塑是至關(guān)重要的，是不可缺少的關(guān)鍵因素，因為它們是祖細胞開始向成骨細胞分化所必需的功能連接元件。在Runt 同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族中，Runx2 是其中一員，它是成骨細胞前體細胞中公認的主要轉(zhuǎn)錄因子，已被認為是成骨細胞的最早標志物[14]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）可以促進間充質(zhì)干細胞（MSC）向成骨分化，而血小板衍生生長因子（PDGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）通過受體酪氨酸激酶（RTK）可以激活其增殖。在人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）中研究了PDGF 或FGF 受體信號通路對BMP2 誘導(dǎo)的成骨細胞分化的影響。抑制PDGF 和FGF 受體可以增強BMP2 誘導(dǎo)的堿性磷酸酶（ALP）活性，以及Osterix，ALP 和骨唾液酸蛋白的表達和基質(zhì)的鈣化。這些影響與Smad-1 活性升高相關(guān)，表明有絲分裂因子干擾HMSC 分化中的Smad 信號。RTK 激活MAPK并通過PI3K / AKT 途徑抑制GSK3。生化分析表明MAPK JNK 和GSK3 是調(diào)節(jié)BMP2 誘導(dǎo)的HASMCs 向成骨細胞分化的潛在信號分子。這些觀察結(jié)果強調(diào)BMP2 的成骨化作用受到RTK 作用的促有絲分裂因子的調(diào)節(jié)。因此，AGEs 可以通過對PI3K/AKT GSK-3β/β-catenin 信號通路的調(diào)控來促進糖尿病體內(nèi)的血管鈣化，但其具體的作用機制尚待進一步研究。

綜上所述，在糖尿病大鼠體內(nèi)運用PI3K/AKT 抑制劑LY294002 后，可通過調(diào)控β-catenin 轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)相關(guān)成骨因子Runx2、OPG 及BMP2 的表達，而減弱主動脈血管壁的鈣化；在運用GSK 抑制劑TWS119 后，可通過調(diào)控β-catenin 轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)相關(guān)成骨因子Runx2、OPG 及BMP2 的表達，而增強主動脈血管壁的鈣化。而且通過糖尿病大鼠體內(nèi)實驗驗證了PI3K/AKT GSK-3β/β-catenin 信號通路或許可以作為治療糖尿病動脈鈣化的新靶點。