張蕾 任嵩 楊嫻婧 孫杰 廖和榮

摘要：本研究旨在挖掘玫瑰冠雞與科寶雞胚胎期胸肌組織中差異表達(dá)基因，探討2種雞肌肉發(fā)育及肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積的分子遺傳機理。本研究利用RNA-Seq技術(shù)對玫瑰冠雞和科寶雞胚胎期胸肌組織中差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes， DEGs）進行篩選，通過GO富集和KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs的功能進行注釋與分析。結(jié)果顯示：4個文庫共鑒定到4 643個差異表達(dá)基因，其中玫瑰冠公雞胸肌和科寶公雞胸肌中有1 909個顯著表達(dá)的基因，以科寶雞為參照，929個上調(diào)，980個下調(diào);玫瑰冠母雞胸肌和科寶母雞胸肌中有2 734個顯著表達(dá)的基因，其中1 444個上調(diào)，1 290個下調(diào)。經(jīng)熒光定量PCR驗證，選取的12個差異基因的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致。GO富集結(jié)果表明，MYL2調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育，MYOG參與肌細(xì)胞的形成與分化;ACACA、ACOX2和ACOX3參與脂肪酸代謝過程;Notch1參與了胚胎發(fā)育及脂肪分化相關(guān)過程。此外，KEGG通路分析結(jié)果顯示，能量代謝相關(guān)的信號通路（mTOR）與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號通路相互作用影響肌纖維的發(fā)育。細(xì)胞連接相關(guān)通路（局部粘附、ECM-受體互作）參與了肌肉脂肪代謝過程。本研究結(jié)果為進一步解析雞優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玫瑰冠雞;科寶雞;胚胎期;胸肌;差異表達(dá)基因;RNA-Seq

中圖分類號：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1237-10

Abstract：This study aimed to identify differentially expressed genes （DEGs） in the embryonic breast muscle tissue of Rose-crowned chicken and Cobb broilers， and to explore the molecular genetic mechanism in muscle development and intramuscular fat （IMF） deposition. RNA-Seq technology was used to screen differentially expressed genes in the embryonic breast muscle tissues of Rose-crowned chicken and Cobb broilers. GO enrichment and KEGG database were used to annotate the functions of DEGs. The results showed that a total of 4 643 differentially expressed genes were identified in the four libraries. Among them， 1 909? genes were significantly expressed in the breast muscle of Rose-crowned cocks and Cobb cocks. Taking Cobb broilers as reference， 929 genes were up-regulated and 980 genes were down-regulated. There were 2 734 significantly expressed genes in the breast muscle of Rose-crouned henes and Cobb hens， 1 444 genes were up-regulated and 1 290 genes were down-regulated. The results of real-time PCR indicated that the expression trend of 12 differential genes was consistent with the sequencing results. Go enrichment analysis results showed that MYL2 regulated the growth and development of skeletal muscle. MYOG was involved in the formation and differentiation of muscle cells. ACACA， ACOX2 and ACOX3 were involved in the fatty acid metabolism. Notch1 was involved in embryo development and adipogenesis-related processes. In addition， KEGG pathway analysis results indicated that the interaction between the energy metabolism-related signaling pathway （mTOR） and muscle development-related signaling pathways affected the development of muscle fibers. Cell junction-related pathways （focal adhesion， ECM-receptor interaction） were involved in IMF metabolism. The results of this study lay the foundation for further analysis of genetic mechanisms associated with high-quality meat quality traits in chickens.

Key words：Rose-crowned chicken;Cobb broilers;embryonic period;breast muscle;differentially expressed genes;RNA-Seq

雞是具有重要經(jīng)濟意義的食用動物，同時廣泛用作胚胎發(fā)育研究的模式動物。肌肉中的肌纖維直徑和橫截面積與肉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，肌纖維密度與肉品質(zhì)呈正相關(guān)，而肌內(nèi)脂肪（IMF）含量影響雞肉的風(fēng)味、多汁性和嫩度[1-3]。肌肉的發(fā)育取決于肌細(xì)胞的發(fā)生，在某種程度上還取決于脂肪的形成[4]。肌肉質(zhì)量和肌內(nèi)脂肪含量均由細(xì)胞數(shù)量和單位細(xì)胞大小決定，胚胎期是肌肉和脂肪組織發(fā)育的關(guān)鍵時期，而肌肉中肌纖維和脂肪細(xì)胞的數(shù)目在胚胎期及發(fā)育早期就被確定，在生長后期僅表現(xiàn)為細(xì)胞的增大和質(zhì)量的增加[5-6]。有研究結(jié)果表明，在雞胚胎發(fā)育的7～10 d，脂肪細(xì)胞成脂標(biāo)志基因PPARα表達(dá)水平逐漸增加，此時肌內(nèi)脂肪快速沉積[7]。Pax基因家族與肌纖維生長發(fā)育密切相關(guān)，廖菁等[8]研究發(fā)現(xiàn)Pax-3在胸肌中的表達(dá)高峰期出現(xiàn)在胚胎期 8～20? d，此后迅速下降并保持穩(wěn)定。本課題組前期研究結(jié)果表明，玫瑰冠雞與科寶雞腿肌均在7胚齡開始出現(xiàn)脂肪沉積，胸肌則在8胚齡開始出現(xiàn)脂肪沉積[9]。也有研究結(jié)果表明胚胎期肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積對出雛后家禽產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)具有決定性作用[10]。Velleman研究發(fā)現(xiàn)火雞在25胚齡時胸肌肌纖維已存在品種和性別的差異，表明胚胎期肌纖維發(fā)育對出生后肌肉發(fā)育潛力有極大影響[11]。Charrin等研究了麻鴨1～98 d IMF的沉積規(guī)律，發(fā)現(xiàn)第1 d胸肌組織中總脂肪含量較高，表明胚胎期脂肪沉積對早期階段的生長和能量需求是必要的[12]。

玫瑰冠雞具有地方雞種良好的肉品質(zhì)及獨特的風(fēng)味，其桑葚狀冠型巨大鮮艷，肉質(zhì)細(xì)嫩，香氣濃郁，極具食用和觀賞價值[13]，科寶雞具有生長速度快、飼料轉(zhuǎn)化率高、屠宰率高等優(yōu)點，尤其是其胸肌肌肉產(chǎn)量，在28 d后可達(dá)到活體質(zhì)量的20%以上，但兩者在生長速度、肌肉品質(zhì)等方面存在顯著差異 [14]。因此，這2個品種是研究雞肌肉生長發(fā)育及肉品質(zhì)遺傳機理的理想動物模型。

雞胚胎期肌肉發(fā)育及脂肪形成受多種基因的影響和調(diào)控，但其潛在的分子機制仍不明確。本研究采用RNA-Seq技術(shù)挖掘和篩選影響玫瑰冠雞、科寶雞胚胎期肌肉發(fā)育及脂肪形成的候選基因和信號通路，以期為闡明雞肉品質(zhì)性狀差異的遺傳機理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

玫瑰冠雞種蛋由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院實驗站提供，科寶雞種蛋由新疆泰昆種雞場提供。所有種蛋均按常規(guī)程序進行孵化，胚胎期第8 d分別采集玫瑰冠雞（M）、科寶雞（K）的胸肌組織（X），置于Trizol試劑中，并迅速放入液氮中保存。將采集的樣品分為4組：玫瑰冠公雞（MGX）、科寶公雞（KGX）、玫瑰冠母雞（MMX）、科寶母雞（KMX），每組3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2RNA提取、轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序

使用Trizol法提取玫瑰冠雞和科寶雞胸肌組織的總RNA，接著采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，然后納米分光光度計、Qubit和Bioanalyzer 2 100分別檢測RNA的質(zhì)量、濃度以及完整性。樣品檢測合格后，使用NEBNext UltraTM Directional RNA Library Prep Kit構(gòu)建文庫。最后，使用Agilent Bioanalyzer 2100對文庫質(zhì)量進行評估，庫檢驗合格后，使用Illumina Hiseq 4000平臺對文庫進行RNA-Seq。

1.3測序數(shù)據(jù)處理與分析

原始序列（Raw reads）中去除低質(zhì)量、帶接頭的序列，獲得高質(zhì)量序列（Clean reads），同時計算Clean reads的Q20、Q30（分別表示 Phred 數(shù)值大于20、30的堿基占總堿基的百分比）和C+G含量。使用Bowti2和 HISAT2 將過濾后的序列定位到雞的參考基因組（http：//asia.ensembl.org/Gallus_gallus/Info/Index）上，比對過程中不容許錯配，后續(xù)分析都基于比對結(jié)果進行。

1.4SNP及可變性剪切分析

通過Samtools和Picard-tools等工具對比對結(jié)果進行染色體坐標(biāo)排序、序列去重復(fù)等處理，然后通過變異檢測軟件GATK2統(tǒng)計每個樣品的單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）和插入缺失突變（Indel）。使用rMATS （http：//rnaseq-mats.sourceforge.net/index.html）對樣品中的可變剪切事件（外顯子跳躍、第一個外顯子可變剪切、最后一個外顯子可變剪切、外顯子選擇性跳躍、內(nèi)含子滯留）進行分類和差異分析。

1.5差異表達(dá)基因分析

使用Cuffdiff （http：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffdiff/index.html）軟件進行定量分析，以FPKM（Fragments per Kilobase Million）來表示基因的表達(dá)量。通過計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson product-moment correlation coefficient）評估品種內(nèi)重復(fù)樣品的相關(guān)性。以差異倍數(shù)值（Fold change）及P<0.05進行差異基因篩選。

1.6差異表達(dá)基因GO和KEGG分析

基于非中心超幾何分布算法，采用GOseq 對差異表達(dá)基因進行GO注釋。采用Kobas 2.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/help.do）找出差異基因參與的顯著性富集的通路。GO注釋及KEGG通路分析均以P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7測序結(jié)果的實時熒光定量PCR驗證

隨機挑選了12個差異表達(dá)基因進行熒光定量PCR，使用primer5設(shè)計特異性引物，選擇U6作為相對定量的內(nèi)參基因，委托上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。反應(yīng)體系（20 μl）：染料10 μl，ddH2O 7 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，最佳退火溫度20 s，72 ℃延伸10 s，共45個循環(huán);95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃ 1 s 。使用2 -△△Ct法對基因的表達(dá)量進行標(biāo)準(zhǔn)化計算。差異性分析使用SPSS 22軟件，以P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

測序結(jié)果顯示，每個樣品產(chǎn)出的原始序列數(shù)量均在91 374 036以上，所得高質(zhì)量的序列所占比例均在95.27%以上。Q20和Q30是衡量測序準(zhǔn)確率的一個重要指標(biāo)，Q20的含量均在96.9%以上，Q30的含量均在92.11%以上，所有樣品中G+C含量集中分布在45.25%～52.02%。Total mapped是比對到參考基因組的高質(zhì)量序列的數(shù)量，所有樣品比對到雞基因組上的高質(zhì)量序列數(shù)量均在92.62%以上，統(tǒng)計結(jié)果見表2。

2.2SNP及其可變剪接

所有樣品中檢測到的SNP數(shù)量為993 778～1 619 033個，從理論上來看，每一個SNP 位點都可以有4 種不同的變異形式，但實際上發(fā)生的只有2種，即轉(zhuǎn)換和顛換，二者之比為1∶2。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T。所有樣品中發(fā)生插入缺失突變事件的數(shù)目為84 008～138 470個，且均位于染色體上。

由圖1可知，2個比較組合中均包含了5類可變剪切事件，且2種方法檢測的結(jié)果相似，均是外顯子跳躍（SE）和外顯子選擇性跳躍（MXE）最多。

2.3差異表達(dá)基因

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，樣本間相關(guān)系數(shù)均在0.902以上（圖2），相關(guān)性高，說明樣品表達(dá)模式相似度高。通過與參考基因組序列進行比對，4個文庫共鑒定到4 643個差異表達(dá)基因，其中，玫瑰冠公雞胸肌和科寶公雞胸肌中有1 909個顯著表達(dá)基因，以科寶雞為參照，其中929個上調(diào)，980個下調(diào)（圖3A）;玫瑰冠母雞胸肌和科寶母雞胸肌中有2 734個顯著表達(dá)基因，其中1 444個上調(diào)，1 290個下調(diào)（圖3B）。通過對差異表達(dá)基因分析，其中有367個基因在4個文庫中共表達(dá)（圖4A），對其進行聚類分析，顯示玫瑰冠雞與科寶雞表達(dá)的基因分別聚類到2個不同的類群，表明2個品種雞表達(dá)的基因存在一定的差別（圖4B）。

2.4差異表達(dá)基因GO富集

利用GOseq對兩品種雞胸肌組織中差異表達(dá)基因進行富集分析，結(jié)果顯示在玫瑰冠公雞胸肌和科寶公雞胸肌中共顯著（P<0.05）富集到1 016個GO條目，包括675個生物過程 （Biological process， BP），171個細(xì)胞組分 （Cellular component， CC）和170個分子功能 （Molecular function， MF）。在玫瑰冠母雞胸肌和科寶母雞胸肌中共顯著（P<0.05）富集到813個GO條目，包括498個BP，185個CC和128個MF。主要涉及到生物代謝過程、細(xì)胞組分、生物合成過程、細(xì)胞增殖和分化及骨骼肌發(fā)育等過程的調(diào)控，其中顯著富集到脂肪酸代謝過程的差異表達(dá)基因包括ACOX2、ACOX3、ACSL1、ACACA等;MSC、SIX1、MYOG、MYL2、MYF6等被顯著富集到骨骼肌發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程中;TWIST1、NOTCH1、WNT3等差異表達(dá)基因被顯著富集到胚胎發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程中（表3）。這些差異表達(dá)基因在兩品種雞胚胎期細(xì)胞的增殖分化、肌肉發(fā)育及脂肪形成過程中存在一定差異，是造成雞肉品質(zhì)性狀差異的重要影響因素。

2.5差異表達(dá)基因的KEGG通路

在 GO 注釋分類的基礎(chǔ)上，對差異表達(dá)基因進行通路顯著性富集分析，KEGG通路分析是可以更清楚地了解基因間相互作用，共同行使生物學(xué)功能的途徑。結(jié)果顯示，玫瑰冠公雞胸肌和科寶公雞胸肌中差異表達(dá)基因顯著富集到10條信號通路，包括ECM-受體互作、核糖體、mTOR信號通路、 RNA降解、RNA轉(zhuǎn)運和mRNA監(jiān)測途徑等。玫瑰冠母雞胸肌和科寶母雞胸肌中差異表達(dá)基因顯著富集到11個信號通路，包括核糖體、碳代謝、氧化磷酸化、RNA轉(zhuǎn)運和mRNA監(jiān)測途徑等。KEGG富集結(jié)果與GO富集結(jié)果相似（圖5），這些差異表達(dá)基因顯著富集的信號通路多與細(xì)胞器、RNA加工和修飾及細(xì)胞的生物學(xué)過程相關(guān)。

2.6實時熒光定量PCR驗證結(jié)果

選取12個差異表達(dá)基因進行熒光定量PCR，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因熒光定量結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果的差異倍數(shù)存在偏差，但兩者在上調(diào)和下調(diào)的表達(dá)趨勢相同（圖6），表明RNA-Seq所得數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確，可進行后續(xù)分析。

3討論

RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，可用于快速生長肉雞與優(yōu)質(zhì)肉雞在肉質(zhì)性狀基因差異表達(dá)、調(diào)控等方面的研究。Zhang等[15]對固始雞肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和腹部脂肪細(xì)胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得了4 403和4 693個差異基因，并顯著富集到PPAR、ECM-受體相互作用、局部粘附及Ca2+等信號通路。束婧婷[16]等利用基因芯片技術(shù)對清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞的比目魚肌進行分析，篩選到20個可能影響肌纖維生長發(fā)育及分化的候選基因。本試驗采取玫瑰冠雞和科寶雞胚胎期第8 d的胸肌組織，使用RNA-Seq技術(shù)探討了2個品種的雞胸肌組織在轉(zhuǎn)錄組水平上的差異，篩選到多個差異表達(dá)基因，并被富集到骨骼肌發(fā)育、脂肪酸代謝過程、細(xì)胞增殖和分化等過程中，這些差異表達(dá)基因可能在胚胎期的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

肌肉發(fā)育過程中，大量基因的特異性表達(dá)形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究篩選到部分與肌肉發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因 ，其中快肌肌球蛋白輕鏈2基因（MYL2）在動物心肌和骨骼肌的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，可能是調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育和影響家畜肉品質(zhì)的候選基因[17-18]。肌細(xì)胞生成素（MYOG）是成肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族的成員之一，在肌肉細(xì)胞的形成與分化過程中有重要的調(diào)控作用[19-20]。本研究顯著富集到在骨骼肌代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，mTOR是動物生長的重要調(diào)控因子，在細(xì)胞的增殖、生長和分化過程起到重要的調(diào)控作用[21]。研究結(jié)果表明，能量代謝相關(guān)的信號通路與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號通路相互作用從而調(diào)控肌肉的生長發(fā)育，這與束婧婷等[16]的研究結(jié)果相似。

肌內(nèi)脂肪是決定肉質(zhì)的重要因素[22-24]，它的沉積和分化受到眾多的基因調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)大量的差異表達(dá)基因參與了 PPAR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）基因通過促進脂肪酸生物合成在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[25]。脂酰輔酶A氧化酶2（ACOX2）基因催化支鏈、長鏈脂肪酸和膽汁酸的前體分子，并參與脂肪酸代謝、脂蛋白代謝和膽汁酸合成以及過氧化物脂類代謝等過程。脂酰輔酶A氧化酶3（ACOX3）基因則催化2-甲基支鏈脂肪酸脫氫氧化生成烯脂酰輔酶A和降植烷酸，它們對脂肪酸氧化均具有正調(diào)節(jié)作用[26-27]。此外，有研究結(jié)果表明，Notch1在成脂過程中表達(dá)量持續(xù)降低，在成熟脂肪細(xì)胞分化末期的表達(dá)量顯著低于分化前[28]，表明Notch1可能抑制脂肪細(xì)胞的分化。GO富集結(jié)果表明，Notch1基因被顯著注釋到多個與胚胎發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程中，提示其在胚胎期脂肪分化過程中可能發(fā)揮重要作用。KEGG 通路分析結(jié)果表明，雞胚胎期IMF 的沉積不僅受到脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和通路的調(diào)節(jié)，還受到維持組織和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)完整性相關(guān)通路（局部粘附、ECM-受體互作）的調(diào)節(jié)和介導(dǎo)，這與Cui等[29]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究采用RNA-Seq技術(shù)挖掘了玫瑰冠雞與科寶雞胚胎期胸肌組織中大量差異表達(dá)的基因，其中MYL2調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育，MYOG參與肌細(xì)胞的形成與分化;ACACA、ACOX2和ACOX3參與脂肪酸代謝過程;Notch1可能參與了與胚胎期脂肪分化相關(guān)的生物學(xué)過程。KEGG分析結(jié)果表明，mTOR信號通路與肌肉發(fā)育相關(guān)信號通路相互作用從而影響肌纖維的發(fā)育，細(xì)胞連接相關(guān)通路（局部粘附、ECM-受體互作）參與了 IMF 代謝過程，這些信號通路形成了一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響雞胚胎期肌肉組織的發(fā)育及脂肪的沉積。本研究初步揭示了影響玫瑰冠雞與科寶雞肌肉發(fā)育和脂肪代謝的差異表達(dá)基因及信號通路，為家禽肉品質(zhì)性狀的改善奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）