霍曉麗　李文良　毛立　楊蕾蕾　劉茂軍　張紋紋　李基棕　孫敏

摘要：綿羊肺炎支原體（MO）和小反芻獸疫病毒（PPRV）都可以造成山羊和綿羊的呼吸系統(tǒng)疾病，二者常呈現(xiàn)混合感染，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的威脅和經(jīng)濟損失，對二者的檢測有助于了解臨床疾病混合感染情況、更好地防控呼吸道疾病。本研究的目的是建立同時檢測綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒的雙重RT-PCR檢測方法。根據(jù)公布的基因序列針對MO和PPRV的16S rDNA和N基因設計合成2對特異性引物，構建標準質(zhì)粒，進而通過退火溫度和引物濃度的優(yōu)化、特異性和靈敏性檢測，建立雙重RT-PCR方法。結果顯示，該方法能特異性擴增MO（359 bp）和PPRV（686 bp）基因片段，其特異性好，敏感性高，對MO和PPRV的最小檢出量分別為103拷貝/μL和102拷貝/μL。對部分臨床樣品檢測結果顯示，該方法可有效檢測這2種病原，與單重PCR具有較高的符合率。本研究建立的雙重 RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性，可用于臨床樣品MO和PPRV感染的快速檢測。

關鍵詞：綿羊肺炎支原體;小反芻獸疫病毒;雙重RT-PCR;標準質(zhì)粒;混合感染

中圖分類號：S858.26?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0185-05

收稿日期：2019-12-10

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（18）2003]。

作者簡介：霍曉麗（1995—），女，山西晉中人，碩士研究生，從事動物疫病診斷防控技術研究。E-mail：942975692@qq.com。

通信作者：李文良，博士，副研究員，從事動物疫病診斷防控技術研究。E-mail：kfliwenliang@163.com。

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，簡稱PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petis ruminants virus，簡稱PPRV）引起的一種具有高度傳染性的動物病毒性疾病[1]。小反芻獸疫引起小反芻動物發(fā)熱、眼和鼻出現(xiàn)大量分泌物、肺炎、白細胞減少、呼吸困難、上消化道潰瘍糜爛和腹瀉等主要癥狀[2]。我國的第一例 PPR 病例于 2007 年發(fā)現(xiàn)于西藏自治區(qū)[3]，2013—2014年PPR再次出現(xiàn)并迅速蔓延至多個省（市）[4-5]。小反芻獸疫傳播迅速，跨度范圍大，感染風險大，給我國動物疫病防控造成了巨大威脅。綿羊肺炎支原體（mycoplasma ovipneumoniae，簡稱MO）是造成羊支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of sheep）的一種重要病原體，是目前影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的主要呼吸道病原[6]。在臨床上表現(xiàn)的主要特征是發(fā)熱、咳嗽、流涕同時出現(xiàn)肺炎和胸膜炎[7]，發(fā)病過程多取急性或慢性，有很高的病死率，呈全球性分布[8]，多流行于中東、東亞、澳洲等養(yǎng)羊業(yè)較為集中的國家。在我國，自 1982年胡景韶等首次分離到 MO以來[9]，羊支原體肺炎流行日益普遍，危害增強，對我國養(yǎng)羊業(yè)造成巨大威脅。

MO和PPRV均為引起山羊呼吸道疫病的主要病原，臨床上常呈現(xiàn)混合感染，因此正確有效地檢測混合感染情況對了解疾病的發(fā)生及防控具有重要意義。支原體分離培養(yǎng)和病毒分離是檢測病原的常用方法，但此方法費時費力，對實驗室條件和生物安全性要求很高，很容易因操作原因?qū)е路蛛x失敗，且絕大部分實驗室不具備病毒分離的條件，這給這2種病原的快速診斷帶來困難。目前對于綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒的檢測已經(jīng)分別建立了分子生物學方法特異的PCR或RT-PCR方法，這種方法可以廣泛應用在對病原的檢測、診斷和流行病學調(diào)查方面[10-11]，但是，建立能夠同時檢測MO和PPRV的PCR方法將更有利于臨床檢測。因此，本研究通過篩選靶基因和引物組合，優(yōu)化反應條件，建立同時檢測MO和PPRV的雙重RT-PCR方法，以期為這2種病原的檢測提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 菌、毒株

山羊支原體（PG3株）、MO（Y98株）、絲狀支原體（F38株）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;PPRV疫苗（PPRV Nigeria 75/1株）購自新疆天康畜牧生物技術股份有限公司;山羊痘活疫苗購自哈藥集團生物疫苗有限公司;藍舌病病毒（BTV）[12]、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）[13-14]、邊界病病毒（BDV）[15]、山羊副流感病毒3型（CPIV3）[16]、山羊皰疹病毒Ⅰ型（CpHV-1）[17]由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、10×K buffer、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司; DH5α感受態(tài)細胞、Trans Zol UP、一步法RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司;DNA/RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank中的MO 16S rDNA序列和PPRV N基因序列，利用Primer 5和MPprimer軟件設計不同的引物組合，然后篩選出2對特異性引物對（表1），引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 標準質(zhì)粒的構建

取200 μL MO培養(yǎng)液置于1.5 mL離心管（RNase free）中，參考核酸提取試劑說明書提取DNA，用引物MO1、MO2進行PCR擴增，反應體系：0.2 mL PCR反應管中加入2×PCR Mix10 μL，上下游引物各0.5 μL，核酸模板2 μL，無菌雙蒸水加至總體積為20 μL，混勻。反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。電泳觀察擴增結果。

將MO和PPRV標準品質(zhì)?；旌衔锇?0倍梯度稀釋為1×108拷貝/μL至1×100拷貝/μL，取每個稀釋度樣品進行雙重RT-PCR檢測，結果（圖7）顯示，該方法對MO的最小檢出量為103拷貝/μL，對PPRV的最小檢出量為102拷貝/μL。

2.6 臨床樣品檢測

利用建立的雙重RT-PCR方法對2015—2018年采集的165份臨床樣本（鼻拭子和血清）進行檢測，瓊脂凝膠電泳結果如表2所示，165份樣本中有79份呈MO陽性，有30份呈PPRV陽性，其中MO和PPRV混合感染的有21份。檢測結果與單一PCR和RT-PCR的檢測結果符合率為：MO 98.7%、PPRV 100%。這說明本試驗建立的雙重RT-PCR檢測方法可有效地對臨床樣品中的MO和PPRV進行快速同步檢測。

3 討論

MO在全球范圍內(nèi)均有分布，且有很高的流行率，筆者所在實驗室近年來對江蘇省及周邊地區(qū)患呼吸道疾病的山羊和綿羊鼻拭子、肺臟等樣品的檢測結果表明，MO普遍存在，該結果在臨床疾病防控中發(fā)揮重要作用。PPRV自2013年年底再次傳入我國多個?。▍^(qū)），造成了巨大的損失，目前雖然通過疫苗免疫已經(jīng)很好控制了疫病的流行和發(fā)生，但仍有散播病例。這2種病原臨床上經(jīng)常混合感染導致羊呼吸道疾病的發(fā)生。PCR和RT-PCR方法操作簡便、快速且檢測結果準確，已被廣泛用于這2種病原的實驗室檢測。但是，目前僅有單獨檢測MO和PPRV的PCR和RT-PCR方法，需分別進行檢測。因此，本研究建立一種一步法雙重RT-PCR方法，以同時、快速、準確、方便地檢測這2種病原。

由于PCR方法敏感性高，容易污染，且PPRV為RNA病毒，檢測時需要先進行反轉錄再進行PCR擴增，而檢測MO時則直接進行PCR擴增，因此，本研究方法采用核酸提取試劑盒從樣品中同時提取DNA和RNA，擴增反應采用一步法RT-PCR方法，以減少操作和加樣步驟，減少污染的機會并提高檢測效率。

引物設計是決定雙重PCR成敗的關鍵。利用多重PCR引物設計系統(tǒng)MPprimer軟件針對MO和PPRV基因分別設計多對引物并進分析篩選最佳引物組合，在設計過程中，不僅要考慮到每對引物的Tm值、GC含量以及引物特異性，還應確保這些引物對之間有相近的Tm值，同時需保證不同的擴增產(chǎn)物在電泳后能夠很清晰地分辨;進而通過試驗驗證篩選針對MO和PPRV的引物組合，用于同時特異地檢測MO和PPRV。在設計篩選過程中發(fā)現(xiàn)，有些引物組合經(jīng)軟件預測效果良好且特異，但試驗驗證時擴增效果不理想，因此在雙重PCR引物設計時，應使用軟件分析篩選多個引物組合并通過試驗驗證其應用效果。使用設計好的引物分別用單重PCR/RT-PCR進行擴增，得到特異性片段并克隆入pMD18-T載體上構建標準質(zhì)粒，作為雙重RT-PCR擴增的標準陽性對照。同時，為了減少引物對間的干擾，獲得最佳檢測效果，本研究對雙重RT-PCR的反應條件進行優(yōu)化，確定最佳引物反應濃度比為1 ∶1，即各上下游引物均為0.5 μL，最佳退火溫度為52 ℃。敏感性和特異性試驗證明，本研究方法具有良好的特異性和較高的敏感性。通過對165份臨床樣品進行檢測證明，雙重RT-PCR的擴增結果與單一PCR和RT-PCR有很高的符合率。臨床樣品中MO感染率較高（約50%），說明MO臨床感染率較高，在PPRV陽性樣品中，有70%（21/30）混合感染MO，表明PPRV與MO混合感染較普遍，在PPRV的臨床檢測時應考慮混合感染情況。

總之，本研究建立的雙重RT-PCR方法可用于同時檢測臨床樣品中的綿羊肺炎支原體和小反芻獸疫病毒，操作簡單、特異性強、敏感性高且可減少污染機會、提高檢測效率，可作為臨床呼吸道疾病樣品快速檢測的有力工具，具有較好的應用前景。

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