戴雨沁　程夢(mèng)雨　顧佩乾　薄雨心， 陳佳豪　齊開(kāi)杰　吳巨友　張紹鈴　王鵬

摘要：液體授粉是梨園省力化生產(chǎn)的重要技術(shù)，然而授粉液配方中硝酸鈣是易制爆危險(xiǎn)化學(xué)品，其購(gòu)買、儲(chǔ)存和應(yīng)用受到很大限制。為篩選方便易得且可以促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的鈣源，替換梨樹(shù)授粉液中的硝酸鈣，以促進(jìn)梨樹(shù)液體授粉技術(shù)的推廣應(yīng)用，共選取8種不同的鈣源，按照相同鈣濃度配制梨樹(shù)授粉液，并從花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)2個(gè)方面分析鈣源對(duì)梨花粉發(fā)育的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)4 h后，以葡萄糖酸鈣為鈣源時(shí)花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度分別是硝酸鈣為鈣源的1.4倍和1.9倍。檸檬酸鈣作用優(yōu)于硝酸鈣，乳酸鈣的作用與硝酸鈣相近，磷酸二氫鈣在促進(jìn)花粉萌發(fā)方面作用明顯，但在促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)方面作用與硝酸鈣處理相近。以氫氧化鈣、氯化鈣和甘氨酸鈣為鈣源時(shí)，梨花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均明顯低于硝酸鈣處理。葡萄糖酸鈣能明顯促進(jìn)梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)，且方便易得，可以替換梨樹(shù)液體授粉配方中的硝酸鈣。

關(guān)鍵詞：梨;液體授粉;鈣;花粉萌發(fā);花粉管生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)： S661.201? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0142-03

收稿日期：2020-02-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31501715;31772276）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（編號(hào)：CARS29）。

作者簡(jiǎn)介：戴雨沁（1999—），女，江蘇南通人，主要從事梨授粉技術(shù)研究。E-mail：1685575356@qq.com。

通信作者：王 鵬，博士，副研究員，主要從事梨授粉受精調(diào)控機(jī)理研究。E-mail：wangpeng@njau.edu.cn。

梨是自交不親和植物，自花授粉不能結(jié)果，只有經(jīng)過(guò)授粉才能保證應(yīng)有的產(chǎn)量和品質(zhì)。梨樹(shù)授粉在傳統(tǒng)上多采用配制授粉樹(shù)以及昆蟲自然傳粉的方法，雖然省時(shí)省力，但是授粉效果不穩(wěn)定，遇到不利天氣會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn);近年來(lái)多采用人工點(diǎn)授花粉，坐果成功率高，但是用工量大，成本很高[1]。液體授粉技術(shù)不僅授粉速度快，節(jié)約花粉，節(jié)省人工，還能夠增加柱頭養(yǎng)分，延長(zhǎng)授粉受精時(shí)間，較好地解決了梨樹(shù)授粉難的產(chǎn)業(yè)問(wèn)題，且對(duì)促進(jìn)坐果、提高梨果實(shí)品質(zhì)具有一定的作用[2-3]。目前該技術(shù)已在新疆、甘肅、山西、江蘇等梨產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用。

梨樹(shù)授粉液主成分包括硝酸鈣、硼酸、蔗糖和黃原膠。硝酸鈣主要提供鈣離子（Ca2+），在授粉液中鈣離子濃度約2 mmol/L。Ca2+是花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)必需的物質(zhì)成分和信號(hào)分子。成熟花粉萌發(fā)時(shí)在萌發(fā)孔附近Ca2+濃度顯著升高，花粉深入柱頭后，與花粉尖端接觸位置的Ca2+濃度顯著升高，以滿足花粉管生長(zhǎng)需要?；ǚ酃苤锈}離子濃度存在一定梯度，花粉管尖端鈣離子濃度呈現(xiàn)波動(dòng)變化。授粉液中鈣離子濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)受到抑制[4-5]。硼是花粉管細(xì)胞壁的重要成分，硼酸與細(xì)胞壁中鼠李半乳糖醛酸2Ⅱ結(jié)合形成結(jié)構(gòu)性果膠網(wǎng)格，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)[6]。授粉液中的蔗糖可以為花粉管生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的滲透壓和豐富的能量來(lái)源。黃原膠作為穩(wěn)定劑，可以使花粉均勻分散在授粉液中，利于實(shí)施噴霧，不堵塞噴頭。因此梨樹(shù)授粉液的4種主要成分都有重要作用，缺一不可。

然而，因?yàn)槭诜垡号浞街械南跛徕}屬于易制爆化學(xué)品，購(gòu)買、儲(chǔ)存和使用都受到嚴(yán)格管制，嚴(yán)重限制了梨樹(shù)液體授粉技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。因此篩選合適的鈣源，替換授粉液中受管制的硝酸鈣，改良梨樹(shù)授粉液的配方，有利于推廣省力化栽培技術(shù)，降低梨果生產(chǎn)成本，促進(jìn)梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究以梨花粉為材料，按照梨樹(shù)授粉液配方，分別添加硝酸鈣、氯化鈣、磷酸二氫鈣、氫氧化鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣和甘氨酸鈣等8種不同的鈣源后，對(duì)梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)進(jìn)行了檢測(cè)，以研究替換硝酸鈣的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用碭山酥梨花粉采自江蘇省徐州市，采集大蕾期梨花，打碎后篩取花藥留用。花藥在25 ℃干燥24 h，待花藥開(kāi)裂，花粉散出后，過(guò)篩去除花藥殘?jiān)?，用硫酸紙包裹花粉，放入硅膠干燥盒中凍存于-20 ℃冰箱。

四水合硝酸鈣、無(wú)水氯化鈣、磷酸二氫鈣、氫氧化鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣、甘氨酸鈣、硼酸、蔗糖、黃原膠均使用分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

分別使用四水合硝酸鈣、無(wú)水氯化鈣、磷酸二氫鈣、氫氧化鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣、甘氨酸鈣，按照鈣離子濃度0.5 g/L配制成授粉液，硼酸0.1 g/L，蔗糖150 g/L，黃原膠4 g/L。按照田間使用的授粉液配制方法，不需調(diào)節(jié)pH值。取少量梨精花粉充分分散在授粉液中，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，25 ℃、100 r/min培養(yǎng)，每隔1 h取液體培養(yǎng)的花粉在顯微鏡下拍照，觀察記錄花粉萌發(fā)率并測(cè)量花粉管長(zhǎng)度，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈣源可以導(dǎo)致授粉液pH值變化

梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的最適pH值是6.5[7]。正常情況下，用硝酸鈣、硼酸、蔗糖和黃原膠配制的授粉液pH值范圍6～7，雖因所用水質(zhì)不同而有所差異，但仍可以滿足梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的需要，通常不需要調(diào)節(jié)pH值。這一特性便于梨農(nóng)掌握授粉液配制技術(shù)，利于液體授粉技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，在篩選可替代硝酸鈣的鈣源時(shí)，不對(duì)pH值進(jìn)行額外調(diào)整。本研究中使用不同鈣鹽所配制的授粉液的pH值見(jiàn)表1。可見(jiàn)使用氫氧化鈣和甘氨酸鈣所配制的授粉液的pH值均大于9，明顯偏高;使用磷酸二氫鈣所配制的授粉液的pH值為4.78±0.13，明顯偏酸性。使用硝酸鈣、氯化鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣和檸檬酸鈣配制的授粉液的pH值接近中性，均在6～7范圍內(nèi)。

2.2 授粉液中不同鈣源對(duì)梨花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響

分別使用硝酸鈣、氯化鈣、磷酸二氫鈣、氫氧化鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣和甘氨酸鈣等8種不同的鈣源，按照相同的鈣離子濃度配制成授粉液。取梨花粉均勻分散在授粉液中，在25 ℃、100 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)。每小時(shí)取樣進(jìn)行顯微拍照，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度（圖1）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同鈣源的授粉液中梨花粉萌發(fā)率有明顯差異。以硝酸鈣配制的授粉液為基準(zhǔn)，磷酸二氫鈣、葡萄糖酸鈣和檸檬酸鈣作為鈣源時(shí)，梨花粉萌發(fā)率明顯高于硝酸鈣;乳酸鈣作為鈣源時(shí)，梨花粉萌發(fā)率與硝酸鈣相當(dāng);氯化鈣、氫氧化鈣和甘氨酸鈣作為鈣源時(shí)，花粉萌發(fā)率明顯低于硝酸鈣。其中以磷酸二氫鈣為鈣源時(shí)，梨花粉萌發(fā)率最高，可以達(dá)到62%;其次為葡萄糖酸鈣，花粉萌發(fā)率達(dá)到56%，均明顯高于硝酸鈣為鈣源時(shí)的花粉萌發(fā)率（約40%）（圖2-A）。

以不同鈣源配制的授粉液對(duì)花粉管生長(zhǎng)也有明顯影響（圖2-B）。以硝酸鈣為鈣源時(shí)梨花粉管4 h 可以生長(zhǎng)136 μm，乳酸鈣和磷酸二氫鈣與硝酸鈣的作用相近，花粉管在4 h后可分別生長(zhǎng)153 μm和123 μm。葡萄糖酸鈣為鈣源時(shí)授粉液中梨花粉管生長(zhǎng)最快，梨花粉管4 h可以生長(zhǎng)259 μm，是硝酸鈣為鈣源時(shí)的1.9倍。檸檬酸鈣促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)的作用也較強(qiáng)，梨花粉管4 h可以生長(zhǎng)196 μm。氯化鈣、氫氧化鈣和甘氨酸鈣為鈣源時(shí)，花粉在授粉液中不能正常生長(zhǎng)，4 h后花粉管平均長(zhǎng)度低于40 μm。

綜合花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)2個(gè)方面，葡萄糖酸鈣配制的授粉液效果最佳，其次為檸檬酸鈣，其促進(jìn)梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的效果均優(yōu)于硝酸鈣。另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)氫氧化鈣、氯化鈣和甘氨酸鈣作為鈣源時(shí)，不能促進(jìn)梨花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，不宜用于授粉液的配制。

3 討論

3.1 pH偏高會(huì)抑制梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)

梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的最適pH值是6.5，授粉液pH值6～7時(shí)，促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的效果最佳，pH值高于8.0，梨花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)均受到顯著抑制，會(huì)造成液體授粉失敗[7-8]。氫氧化鈣和甘氨酸鈣配制的授粉液pH值均高于9.0，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以之為鈣源時(shí)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)均受到明顯抑制。以磷酸二氫鈣配制的授粉液pH值為4.78±0.13，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磷酸二氫鈣為鈣源時(shí)較硝酸鈣對(duì)梨花粉萌發(fā)率有更明顯的促進(jìn)作用，但是對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)的促進(jìn)作用與硝酸鈣差異不明顯。磷酸二氫鈣在水中溶解度較小，僅為18 g/L（20 ℃），不易配制溶液，不推薦用于授粉液配制。

3.2 授粉液中氯離子抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)

花粉管生長(zhǎng)不需要氯離子（Cl-）[9]，Cl-對(duì)花粉管生長(zhǎng)有抑制作用[10]。在本試驗(yàn)中，授粉液中Ca2+濃度為2.12 mmol/L，以CaCl2為鈣源時(shí)，授粉液中Cl-的濃度為4.24 mmol/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，CaCl2為鈣源時(shí)花粉管生長(zhǎng)受到明顯抑制，培養(yǎng)4 h后，梨花粉管長(zhǎng)度為39 μm，僅為硝酸鈣配制授粉液時(shí)花粉管長(zhǎng)度的28%，因此CaCl2不宜用于授粉液配制。

3.3 葡萄糖酸鈣是一種易得易用的梨樹(shù)授粉液鈣源

試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖酸鈣和檸檬酸鈣作為鈣源對(duì)梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的促進(jìn)作用優(yōu)于硝酸鈣。葡萄糖不僅可以作為能量物質(zhì)，還是參與花粉管生長(zhǎng)調(diào)控的信號(hào)分子[11]，本試驗(yàn)中葡萄糖酸鈣促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的作用明顯，培養(yǎng)4 h后，以葡萄糖酸鈣為鈣源時(shí)梨花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度分別是硝酸鈣為鈣源時(shí)的1.4倍和1.9倍。葡萄糖酸鈣易溶于沸水，溶解度可達(dá)200 g/L，梨樹(shù)授粉液中Ca2+濃度為2.12 mmol/L，葡萄糖酸鈣用量為9 g/L。葡萄糖酸鈣作為一種食品添加劑易于獲得質(zhì)量穩(wěn)定、純度高的產(chǎn)品，價(jià)格便宜，容易購(gòu)買，方便存儲(chǔ)，沒(méi)有食品安全隱患[12]，本試驗(yàn)表明其對(duì)梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，是替換硝酸鈣的優(yōu)化選擇。

參考文獻(xiàn)：

[1]王兆龍，王義菊，姜福東，等. 梨不同授粉措施的研究進(jìn)展[J]. 煙臺(tái)果樹(shù)，2019，146（2）：3-4.

[2]齊開(kāi)杰，陶書田，吳巨友，等. 梨樹(shù)省力化液體授粉技術(shù)[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)，2017，46（3）：168-169.

[3]魏樹(shù)偉，冉 昆，王宏偉，等. 液體授粉技術(shù)對(duì)梨坐果和果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 落葉果樹(shù)，2017，49（5）：16-17.

[4]盛仙永，胡正海. Ca2+、pH在花粉及萌發(fā)花粉管生長(zhǎng)中的作用研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（1）：194-199.

[5]柴夢(mèng)穎，李秀根，張紹鈴. 梨授粉受精影響因素研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)果樹(shù)，2005（5）：51-53.

[6]Blevins D G，Lukaszewski K M. Boron in plant structure and function[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1998，49：481-500.

[7]張紹鈴，陳迪新，康 瑯，等. 培養(yǎng)基組分及pH值對(duì)梨花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（2）：225-230.

[8]王 鵬，曹 鵬，齊開(kāi)杰，等. 水質(zhì)對(duì)梨樹(shù)液體授粉的花粉萌發(fā)率的影響[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)，2018，47（2）：145-147.

[9]Messerli M，Smith P J，Lewis R C，et al. Chloride fluxes in lily pollen tubes：a critical reevaluation[J]. The Plant Journal，2004，40（5）：799-812.

[10]Breygina M A，Matveeva N P，Ermakov I P. The role of Cl- in pollen germination and tube growth[J]. Russian Journal of Developmental Biology，2009，40（3）：157-164.

[11]Hirsche J，García Fernndez J M，Stabentheiner E，et al. Differential effects of carbohydrates on arabidopsis pollen germination[J]. Plant & Cell Physiology，2017，58（4）：691-701.

[12]食品添加劑 葡萄糖酸鈣：GB 15571—2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.