唐鳳鸞　郭麗君　趙健　毛世忠

摘要：以走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）健壯瓶苗為試驗材料，通過正交設計研究了不同基本培養(yǎng)基、不同濃度IAA和NAA及培養(yǎng)材料類型對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)及移栽的影響。結果表明：（1）在生根培養(yǎng)中起主導作用的因素是基本培養(yǎng)基，在生根苗移栽中起主導作用的因素是培養(yǎng)材料類型和基本培養(yǎng)基;（2）生根率受影響最大，其次為根長，主根數最小;（3）走馬胎生根培養(yǎng)最佳組合為1/2 MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+頂芽;（4）帶葉莖段可用作走馬胎組培苗生根培養(yǎng)材料，生根率達88.95%，這與傳統(tǒng)木本植物組織培養(yǎng)生根材料使用頂芽不同，具有一定創(chuàng)新性。本研究技術能有效提高培養(yǎng)材料使用率，減少藥品用量，降低生產成本，可用于走馬胎種苗規(guī)模化生產。

關鍵詞：走馬胎;規(guī)模生產;生根;材料類型;正交試驗

中圖分類號： S567.1+90.43? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0030-05

收稿日期：2019-12-20

基金項目：廣西科技計劃 （編號：桂科AB16380212）。

作者簡介：唐鳳鸞（1978—），女，廣西桂林人，副研究員，主要從事生物技術與珍稀瀕危植物保育研究。E-mail：tfl7288@163.com。

通信作者：趙 健，副研究員，主要從事栽培與生物技術研究。E-mail：358788030@qq.com。

走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）屬紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）常綠灌木，是我國西南地區(qū)少數民族常用藥材，主治跌打損傷、風濕疼痛等，民間常有“兩腳行不開，不離走馬胎”之說。近年來，隨著人們對植物化學和藥理作用研究的深入，走馬胎的新功能不斷被發(fā)現，如三萜皂苷類成分對HeLa、MCF-7、BCG-823、EJ、Hepg2 等多種腫瘤細胞有明顯抑制作用[1-4]，巖白菜素類衍生物能清除逆境產生的自由基，具有較強的抗氧化能力[5]，因此走馬胎越來越受到人們的重視。

走馬胎種子稀少，莖干分枝能力非常弱，利用傳統(tǒng)的播種和扦插方法繁殖種苗難以滿足生產需求。目前有關走馬胎組織培養(yǎng)的研究已有報道[6-8]，在生根培養(yǎng)階段，王強等均以不定芽單株為材料，MS為基本培養(yǎng)基獲得生根植株[7-8];而唐鳳鸞等發(fā)現，走馬胎帶葉莖段在以1/2MS為基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)配方上也能獲得較好的培養(yǎng)效果[6];然而在木本植物組織培養(yǎng)中普遍認為，低濃度的無機鹽更容易誘導其產生不定根[9-10]，并能減少藥品用量，降低生產成本。筆者在試驗中發(fā)現，利用腋芽繁殖的走馬胎種苗葉片寬厚，莖干粗壯，質量好，但由于該物種的頂端優(yōu)勢非常強，即使在組織培養(yǎng)中也基本只有1個側芽萌發(fā)，極少出現2個或以上芽生長，這對木本植物以帶葉頂芽為培養(yǎng)材料進行生根誘導的傳統(tǒng)方法非常不利，嚴重降低了材料的使用效率，不利于生產成本的控制;同時發(fā)現，不同方法培養(yǎng)的走馬胎組培苗對移栽管護技術要求不同，部分方法雖然能獲得較好的生根率，但植株葉片質地薄，角質化程度低，極易失水萎蔫，非常不利于移栽，成活率也得不到保障。因此，為了明確培養(yǎng)基成分和各類培養(yǎng)材料對走馬胎瓶苗生根及移栽的影響，提高種苗生產效率并控制成本，本試驗研究不同基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)材料類型及植物生長調節(jié)劑對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的影響，以期為走馬胎組培種苗的生產提供更實用的技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）生根培養(yǎng)的材料是由廣西桂林周邊地區(qū)的野生走馬胎植株的幼嫩枝條經過啟動、增殖培養(yǎng)獲得的，為高度達6.0 cm以上的健壯瓶苗。

1.2 試驗方法

試驗于2019年1—12月分別在廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所生物技術中心組培實驗室及育苗大棚內進行。

1.2.1 不同因素對瓶苗生根培養(yǎng)的影響試驗

在前期走馬胎組織培養(yǎng)試驗的基礎上，選取葉片碩大、莖干粗壯、色澤純正的走馬胎組培苗，將其分別剪成帶2張半張葉的頂芽、帶2張半張葉的莖段和無葉莖段3類材料，莖長均達2.0 cm以上;將3類材料分別接種于含不同基本培養(yǎng)基、不同濃度生長素（IAA）和萘乙酸（NAA）的生根培養(yǎng)基中，采用4因素3水平L9（34）正交設計進行試驗（表1）。試驗共設9個處理，每個處理接種20瓶，每瓶接種15個材料，重復3次。

1.2.2 生根培養(yǎng)試驗結果驗證

對正交試驗結果進行統(tǒng)計分析，總結出優(yōu)選培養(yǎng)方案，并通過驗證試驗及擴大生產對優(yōu)選方案進行可靠性檢驗。驗證試驗每個處理接種20瓶，每瓶接種15個材料，重復3次;擴大生產每個處理至少接種1 000瓶，隨機統(tǒng)計100瓶。

向培養(yǎng)基中另加30 g/L蔗糖和 6.0 g/L 瓊脂，調節(jié)pH值為5.5～6.0。分裝后于124 ℃下消毒 22 min。培養(yǎng)室采用日光燈為光源，光照度為40～60 μmol/（m2·s），照射時間為 12 h/d;培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃。

1.2.3 不同條件下培養(yǎng)的生根苗移栽試驗

將通過正交試驗獲得的生根瓶苗從培養(yǎng)室移到大棚，煉苗7～10 d后取出，清洗干凈培養(yǎng)基，并用甲基托布津50倍液浸泡1～2 min，再移栽于園土、泥炭、珍珠巖體積比為3 ∶1 ∶1的混合基質中，在85%蔭蔽度的大棚中培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計分析

觀測記錄接種50 d后走馬胎瓶苗的生根率、主根數、平均根長、側根和莖葉生長情況及生根苗移栽50 d后的成活率。生根率=生根苗數/接種苗總數×100%，主根數為從苗莖基部長出的根數，平均根長=主根總長度/總根數，移栽成活率=移栽后成活苗數/移栽總苗數×100%。試驗數據采用Excel、SPSS 16.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同因素對走馬胎瓶苗生根培養(yǎng)的影響

將生根材料接入培養(yǎng)基約1周后莖段基部膨大，2周后可見白色粗壯的不定根形成，此時腋芽開始萌動生長，40 d后形成完整植株。培養(yǎng)50 d后的觀測結果（表2）表明，各因素對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中根系誘導和莖葉生長的影響差異較大。1號處理至6號處理生根率高、主根數量多、側根發(fā)達、根系生長均勻，且莖葉生長良好，色澤純正（圖1）;9號處理雖然植株生根率達97.78%，但根數少，根系弱，莖干細;7號處理和8號處理不僅生根率低，分別只有68.52%和58.89%，而且根莖葉整體生長效果差。

2.2 不同條件下走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的統(tǒng)計分析

對觀測結果進行極差分析可知（表3），各因素對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中生根率的影響大小順序為基本培養(yǎng)基>培養(yǎng)材料類型>NAA>IAA，對主根數量的影響大小順序為基本培養(yǎng)基> IAA>NAA >培養(yǎng)材料類型，對平均根長的影響大小順序為基本培養(yǎng)基>NAA>IAA>培養(yǎng)材料類型;其中基本培養(yǎng)基對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的影響最大，IAA、NAA、培養(yǎng)材料類型3個因素對生根率和主根數量的影響接近。進一步進行方差分析，結果顯示，4個測試因素對生根率的影響均達到極顯著水平（P<0.01，F0.01=8.02），基本培養(yǎng)基和NAA對平均根長的影響達到極顯著水平（P<0.01，F0.01=8.02），僅基本培養(yǎng)基對主根數量的影響達到極顯著水平（P<0.01，F0.01=8.02）。由此可見，基本培養(yǎng)基類型在走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中起主導作用。

對各因素不同水平培養(yǎng)條件下的植株生根率、平均主根數量和根長進行多重比較分析，結果（表3）發(fā)現，使用不同基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果差異顯著（P<0.05），當基本培養(yǎng)基為1/2MS時有利用走馬胎組培苗生根培養(yǎng)，其生根率、主根數量和平均根長均最大;其次為MS，除主根數量與1/2MS差異顯著外（P<0.05），其他培養(yǎng)效果與1/2MS接近;1/2MS+5 mg/L 維生素B2培養(yǎng)效果最差，對應生根率、主根數量和平均根長分別只有75.06%、1.21條和2.67 cm。不同濃度NAA對生根率和平均根長的培養(yǎng)效果差異顯著（P<0.05），當NAA濃度為10 mg/L時有利于走馬胎組培苗根系誘導及伸長，生根率和平均根長分別為98.70%、4.29 cm，其次為1.5 mg/L;不同濃度IAA和培養(yǎng)材料類型對生根率的影響差異也達顯著水平（P<005），其中 2.0 mg/L IAA和頂芽的培養(yǎng)效果最好，生根率分別為98.52%、98.86%;IAA、NAA和培養(yǎng)材料類型對走馬胎組培苗主根數量的影響差異不明顯。

從分析結果可以看出，根據走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中生根率、平均根長各因素的最佳水平為 1/2MS、2.0 mg/L IAA、1.0 mg/L NAA、頂芽，根據主根數量各因素的最佳水平為1/2MS、1.0 mg/L IAA、1.0 mg/L NAA、帶葉莖段。但在植物組織培養(yǎng)中，當組培苗根系生長正常時，其生根培養(yǎng)的主要考核指標為生根率和根條數，又因2.0 mg/L IAA、頂芽與1.0 mg/L IAA、帶葉莖段對生根率影響差異顯著（P<005），而對平均主根數量效果差異不明顯（P>005），故綜合考慮植株根系及莖葉生長情況、主效因素等認為，1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+頂芽為走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的最佳組合;帶葉莖段的生根率和主根數量分別達88.95%和3.20條，均處于較好水平，也可用作走馬胎組培苗生根培養(yǎng)。

2.3 驗證試驗及擴大生產結果

在正交試驗基礎上，對1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+頂芽的生根組合（組合1）及以1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA為生根培養(yǎng)基接種帶葉莖段（組合2）的實際培養(yǎng)效果進行驗證。結果在驗證試驗中，組合1的生根率為10000%、主根數量為4.95條，組合2的生根率為92.80%、主根數量為4.24條;在擴大生產中，組合1的生根率為95.6%、主根數量為4.18條，組合2的生根率為89.67%、主根數量為4.35條。可見以1/2MS+2.0 mg/LIAA+1.0 mg/L NAA為生根培養(yǎng)基時，頂芽和帶葉莖段均可用于走馬胎組培苗生根培養(yǎng)。

2.4 不同因素對走馬胎生根苗移栽的影響

由表2可知，不同因素組合處理培養(yǎng)的走馬胎生根苗在移栽環(huán)節(jié)成活率差異較大，其中7號處理移栽成活率為100%，1、5、6、9號等4個處理的成活率均達95%及以上，2號和3號處理成活率較低，分別僅為66.43%和43.97%。極差和方差分析結果表明，各因素對走馬胎組培生根苗移栽成活率的影響大小順序為培養(yǎng)材料類型>基本培養(yǎng)基> IAA>NAA，且材料類型和基本培養(yǎng)基的影響達顯著水平（P<0.05）（表4）。對各因素中不同水平間的成活率進行多重比較分析（表4），發(fā)現在不同的基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)材料類型和IAA濃度下差異顯著（P<005），其中MS、1/2MS、頂芽、帶葉莖段及1.0 mg/L IAA的效果較好。這與生根培養(yǎng)和驗證試驗結果相呼應，進一步說明試驗結果具有可靠性。

3 結論與討論

從觀測結果看，不同培養(yǎng)材料類型對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的外觀生長影響差異較明顯，其中以頂芽和帶葉莖段為材料培養(yǎng)形成的生根植株葉片寬厚、健壯，且數量較多;以無葉莖段培養(yǎng)的生根植株不僅葉片質地薄、葉面積小，而且數量也少。經統(tǒng)計分析后發(fā)現，培養(yǎng)材料類型可極顯著影響走馬胎組培苗的生根率（P<0.01，F0.01=8.02），生根率大小表現為頂芽>帶葉莖段>無葉莖段，但對主根數量和平均根長的影響差異不明顯。鑒于頂芽和帶葉莖段對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的整體影響，而且?guī)~莖段的生根率也可達88.95%，因此在實際生產中可將較高的不定芽剪成符合要求的頂芽和帶葉莖段進行生根培養(yǎng)，從而提高材料的利用率。